Entwicklung und Testung genetisch kodierter NO-Sensoren zur Messung von NO-Konzentrationsveränderungen in einzelnen Zellen an hoch auflösenden Fluoreszenzmikroskopen / Emrah Eroǧlu

• VerfasserIn: Eroǧlu, Emrah
• Place / Publishing House: 2014
• Year of Publication: 2014
• Language: English
• Classification: 42.15 - Zellbiologie; 42.03 - Methoden und Techniken der Biologie
• Physical Description: 76 Bl.; graph. Darst.
• Notes: Abweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des Verfassers; Zsfassung in dt. Sprache

ger: Stickstoffmonoxid radikale (NO) sind kurzlebige Moleküle die in vielen physiologischen und pathophysiologischen Prozessen eine bedeutende Rolle spielen. Für das Verständnis der Funktionen von NO als zellulärer Botenstoff ist es wichtig, die dynamische Regulierung von NO in lebenden Zellen messen zu können. Leider haben sich die bisherigen beschriebenen Methoden des NO Nachweises als wenig tauglich für die Messung von NO Konzentrationsveränderungen in einzelnen Zellen erwiesen. Deshalb gibt es trotz jahrzehnter langer Forschung in diesem Feld noch immer Kontroversen über die Dynamik der NO Homöostase in einzelnen Zellen. In dieser Arbeit wird eine neue Klasse von fluoreszenzprotein-basierenden genetisch kodierten NO Sensoren vorgestellt, die es erlauben NO auf direktem Wege in einzelnen Zellen zu messen. Die Fusion eines bekannten NO sensitiven bakteriellen Transkriptions-Faktors norR, oder norR Domänen mit verschiedenen fluoreszierenden Eiweißmolekülen ergab funktionelle NO-Sensoren, welche als sogenannten geNOps bezeichnet wurden. Diese geNOps stehen nun als cyan, grün, gelb und orange fluoreszierende NO Sensoren zur Verfügung, welche hochsensitiv, selektiv und in reversibler Form Echtzeitmessungen von NO-Signalen in einzelnen Zellen erlauben. Erste Ergebnisse zeigen, dass sich die Sensoren für physiologische Messungen in Endothelzellen ausgezeichnet eignen. In dieser Arbeit wurden Ca2+--induzierte NO Signale mit Hilfe der geNOps-Technologie in Endothelzellen visualisiert. Die Zukunft wird zeigen, inwieweit die Einführung von geNOps eine neue Ära des NO-Bio-Imagings ermöglichen wird.

eng: Nitric oxide (NO) is a short-lived radical with a wide range of biological effects that are involved in multiple physiological and pathological processes. Given the importance of NO in biology, the measurement of NO dynamics in living cells is obvious. However, direct NO imaging emerged as a difficult task. We have generated a novel class of genetically encoded fluorescent NO probes, the geNOps, by fusing fluorescent proteins of different spectral properties to the NO-binding domain of norR, a bacterial transcription factor. This approach resulted in cyan, green, yellow and orange fluorescent constructs that directly, specifically and reversibly respond to NO by a significant reduction of the fluorescence intensity and allow bio-imaging of cellular NO dynamics in real time. In endothelial cells geNOps were used to study the dynamics of Ca2+-induced NO biosynthesis. This class of probes opens a new era of NO bioimaging.