The dynamic nature of antigen receptors / by Monica L. Fernández-Quintero

• VerfasserIn: Fernández-Quintero, Monica Lisa Ines
• Place / Publishing House: Innsbruck, [2020]
• Year of Publication: 2020
• Language: English
• Classification: 35.06 - Computeranwendungen; 35.62 - Aminosäuren. Peptide. Eiweiße; 35.10 - Physikalische Chemie: Allgemeines
• Physical Description: 278 Seiten; Illustrationen, Diagramme
• Notes: Abweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des Verfassers; Kumulative Dissertation aus zwölf Artikeln; Im Artikel sind H und V tiefgestellt

ger: Antikörper sind ein zentraler Bestandteil des adaptiven Immunsystems. In den letzten Jahrzehnten ist das Interesse an Antikörpern speziell in der Pharmaindustrie angestiegen, da sie sich durch ihre langen Halbwertszeiten, hohen Spezifitäten und Bindungseigenschaften besonders gut als Therapeutika eignen. Um die biophysikalischen Eigenschaften und die Funktionen der Antikörper besser zu verstehen ist eine detaillierte, strukturelle Beschreibung der Antigenbindestelle, des Paratops, erforderlich. Besonders zentral in der Erkennung und Bindung des Antigens ist die die sogenannte hypervariable Region, oder allgemein „complementarity determining region“ (CDR). Die CDR besteht aus sechs hypervariablen Loops, die stark die Form und Eigenschaften des Paratops beeinflussen. Fünf von diesen sechs CDR Loops können sogenannten kanonischen Strukturen zugeordnet werden, die auf der Annahme basieren, dass die CDR Loops nur eine limitierte Anzahl an Rückgratkonformationen einnehmen können. Die Definition von kanonischen Strukturen, basierend auf experimentellen Kristallstrukturen, in Kombination mit dem gut konservierten Grundgerüst von Antikörpern, erlaubt ein gute Strukturvorhersage. Ein Loop hingegen (CDR-H3), welcher eine zentrale Rolle in der Antigenerkennung spielt, lässt sich aufgrund seiner strukturellen und sequentiellen Diversität nur schwer vorhersagen. Im Zuge meiner Dissertation hat sich herausgestellt, dass nicht nur der CDR-H3 Loop außerordentlich flexibel ist, und daher nicht sinnvoll mit nur einer einzigen statischen Struktur beschrieben werden kann, sondern dass dies auf alle CDR Loops zutrifft. Eine sinnvolle Beschreibung dieser Loops ist nur möglich wenn sie als Strukturensembles in Lösung betrachtet werden. Eine detaillierte Analyse der dynamischen Eigenschaften aller CDR Loops hat gezeigt, dass wir in molekulardynamischen Simulationen Übergänge zwischen den experimentell definierten kanonischen Strukturen beobachten und sogar noch zusätzliche potenziell relevante Lösungsstrukturen identifizieren können. <br /><br />Die Analyse von zahlreichen Antikörpern hat gezeigt, dass es sich bei der bindefähigen Konformation gleichzeitig auch um die dominante Lösungsstruktur handelt. Weiters konnten wir für zahlreiche Beispiele zeigen, dass Antikörperkristallstrukturen des Antigen-bindenden Fragments (Fab), welche ohne das Antigen kristallisiert wurden, starke Kristallpackungseffekte aufweisen können, welche die Konformationen der einzelnen CDR Loops verändert und verzerrt. Diese Resultate in Kombination mit der außerordentlichen Flexibilität der einzelnen CDR Loops, stellen das Konzept, die individuellen CDR Loops mit einer einzigen statischen Struktur zu repräsentieren, in Frage.<br /><br />Ein weiterer zentraler Aspekt in der Strukturvorhersage und im Gebiet des Antikörperdesigns ist die relative Orientierung der beiden variablen Domänen VH und VL zueinander, da diese relative Orientierung die Oberfläche und Form des Paratops stark beeinflusst. Molekulardynamische Simulationen in Kombination mit NMR Experimenten haben gezeigt, dass sich die Dynamik der relativen Orientierung der beiden Domänen auf der 0.1 bis 10 Nanosekunden Zeitskala abspielt. Diese Flexibilität und die potentiellen Implikationen für Spezifität sollten unbedingt beim Design und der Optimierung von therapeutischen Antikörpern berücksichtigt werden.<br /><br />Ein weiterer essentieller Prozess des Immunsystems ist die Affinitätsreifung von Antikörpern, die nach dem ersten Kontakt mit dem Antigen eintritt. Während der Affinitätsreifung werden durch mehrere Runden von somatischer Hypermutation Antikörper mit höherer Spezifität und Affinität produziert. Um diesen Reifungsprozess zu verstehen, der eine zentrale Bedeutung in der Entwicklung von therapeutischen Antikörpern hat, haben wir einige Paare von Antikörperfragmenten analysiert, die sich in ihrer Spezifität unterscheiden und sich in verschiedenen Phasen der Affinitätsreifung befinden. Es hat sich herausgestellt, dass das Verständnis der Dynamik von Antikörpern und die damit verbundenen globalen und lokalen Unterschiede der Flexibilität im Zuge der Affinitätsreifung, von besonderer Bedeutung sind. Für alle zehn Antikörperpaare können wir eine signifikante Rigidifizierung der Flexibilität und Plastizität beobachten.<br /><br />Eine weitere zentrale Herausforderung im Antikörperdesign ist das Abstimmen der Spezifität, um auf der einen Seite “cross species toxicity tests” zu erlauben und auf der anderen Seite um „off target“ Effekte zu vermeiden. Die größte Hürde in der Entwicklung von Therapeutika liegt in der Überwindung der Tendenz Immunantworten gegen nicht vom Menschen abstammenden Antikörpern auszulösen. Für fünf Antikörperhumanisierungsbeispiele haben wir den Einfluss des Antikörpergrundgerüsts, Punktmutationen und unterschiedlichen Spezifitäten auf die CDR-H3 Loop Dynamik untersucht. Unsere Resultate haben die Notwendigkeit zur Charakterisierung und Optimierung von Dynamikunterschieden im Zuge der Humanisierung aufgezeigt.<br /><br />Neben Antikörpern spielen auch T-Zell Rezeptoren (TCRs) eine zentrale Rolle im Immunsystem und rücken immer mehr ins Interesse der Pharmaindustrie. TCRs und Antikörper sind sich strukturell sehr ähnlich, wobei TCRs darauf spezialisiert sind peptidische Antigene zu erkennen, welche an den Haupthistokompatibilitätskomplex binden. Ähnlich zu Antikörpern sind die CDR Loops und zwei zusätzliche Loops, die sogenannten vierten Loops (LV4 und HV4), die wichtigsten Regionen in der Erkennung und Bindung von Antigenen. Unsere Resultate für TCRs verdeutlichen nicht nur einen zentralen Aspekt von Protein-Protein Interaktionen, sondern zeigen auch, dass Affinitätsreifung zur Rigidifizierung der CDR Loops, im speziellen CDR2 und HV4 Loops, führt.<br /><br />Zusammenfassend kann man sagen, dass all diese Resultate und Schlussfolgerungen, weitreichende Implikationen im Gebiet der Antikörperstruktur und Design haben und das bisherige Verständnis von Antikörper und TCR CDR Loop Strukturen verbessern.

eng: Antibodies are key players as therapeutic agents because of their ability to bind the majority of targets and their suitability for protein engineering. Description of the binding properties and characterization of the paratope is essential for understanding the function of the antibody. In the antigen-binding process, the most important region is the complementarity-determining region (CDR), which consists of six hypervariable loops that shape the paratope. Five of the six CDR loops have been assigned to so-called canonical structures, assuming that the CDR loops adopt a limited number of main-chain conformations. We show that the CDR loops are not confined to static canonical conformations but rather exist as conformational ensembles. Using cutting-edge computer simulation techniques, we demonstrate that the CDR loops move within these ensembles leading to conformational rearrangements in the microsecond timescale. The analysis of these conformational ensembles reveals, that in the vast majority of cases, the antigen binding competent conformation is the dominant conformation in solution and antigen-binding fragment (Fab) X-ray structures very frequently are strongly distorted by crystal contacts. We have analyzed a considerable number of antibodies, but we do not find a single case of induced-fit binding. As some of these antibodies have been discussed as prime examples of induced-fit binding during the last decades, our understanding of CDR loop structures seems to be misguided by crystal-packing effects in Fab X-ray structures. Seemingly, antibody structures are optimized to bind their antigens. We demonstrate that the CDR-H3 loop is the most flexible CDR loop typically undergoing large conformational changes in the fast microsecond timescale. However, also other CDR loops undergo considerable conformational rearrangements normally at a slower microsecond timescale. We analyzed a substantial number of CDR interfaces and consistently find, that all CDR loops are interchanging between different kinetic minima.<br />For the CDR-L3 loop we find cases, where indeed the supposed canonical conformation is the dominant structure in solution. For a large number of sequences several canonical structures are within the same kinetic minimum. We also observe cases, where the dominant structure in solution is off the supposed canonical structure, either in another canonical structure or in a minimum not described by any canonical structure. Thus, our results strongly indicate that the strategy and even the concept to represent the CDR loops by one single static structure needs to be reconsidered.<br />Another major objective in antibody design is the relative orientation of the VH and VL domains, because of their strong influence on the shape of the antigen‐binding site. In agreement with NMR experiments and molecular dynamics simulations, we show a considerable binding site flexibility in the low nanosecond timescale. Thus, we suggest that this flexibility and its implications for binding and specificity should be considered when designing and optimizing therapeutic antibodies.<br />Antibodies can rapidly evolve in specific response to antigens. During the affinity maturation process the immune system produces antibodies with higher specificity and affinity through various rounds of somatic hypermutations in response to an antigen. Elucidating the affinity maturation process is fundamental in understanding immunity and in the development of biotherapeutics. Therefore, we analyzed pairs of antibody fragments differing in their specificity and in distinct stages of affinity maturation. We investigated differences in flexibility of the CDR-H3 loop and global changes in plasticity upon affinity maturation. Among all antibody pairs we observed a substantial rigidification in flexibility and plasticity reflected in a substantial decrease of conformational diversity.<br />A key challenge in antibody design is tailoring their binding specificity on the one hand to allow cross species toxicity tests but on the other hand to avoid off target effects. The major hurdle in developing therapeutics still lies in overcoming the tendency to show immunogenic responses to non-human derived antibodies. We studied five antibody humanization series to investigate the influence of the framework, point mutations and specificity on the CDR-H3 loop dynamics. Our results revealed that characterization and optimization of changes of conformational diversity upon humanization emerges as a key aspect of antibody humanization.<br />Aside from antibodies also T-cell receptors (TCRs) play a crucial role in the immune system and have become of high interest for the pharmaceutical industry. TCRs and antibodies share a similar structure and ß-fold, however, TCRs are specialized to recognize peptide antigens, which are binding in the groove of the major histocompatibility complex. The most important regions for target recognition are again the CDR loops and the two “fourth loops” (LV4 and HV4 loops) present and interacting in the binding interface. Our results do not only elucidate a key aspect in biomolecular protein-protein interaction, but also show that affinity maturation leads to a rigidification of the CDR2 and HV4 loops.<br />Our findings have broad implications in the field of antibody structure design and engineering and will lead to a paradigm change for antibody and TCR CDR loop structures and dynamics and enhance the understanding of the antigen-binding process.