Defining the role of CHK1 in hematopoiesis, B-cell development and lymphomagenesis / by Fabian Schuler, M. Sc.

• VerfasserIn: Schuler, Fabian
• Place / Publishing House: Innsbruck, November 2017
• Year of Publication: 2017
• Language: English
• Classification: 42.15 - Zellbiologie; 42.23 - Entwicklungsbiologie; 42.13 - Molekularbiologie
• Physical Description: 136 Blätter; Illustrationen, Diagramme
• Notes: Kumulative Dissertation aus vier Artikeln; Zusammenfassung in deutscher Sprache

ger: Checkpoint kinase 1 (CHK1) spielt eine wesentliche Rolle bei der intrinsischen Zellzykluskontrolle und der Reaktionen einer Zelle auf DNA-Schäden. Aus diesem Grund wurden CHK1-Inhibitoren entwickelt, die auch schon in klinischen Studien getestet werden, um sich schnell teilende Krebszellen, welche den Tumorsuppressor p53 mutiert oder verloren haben, gezielt zu bekämpfen. Studien an Mäusen, denen eine Kopie von CHK1 fehlt, haben gezeigt, dass CHK1 ein Tumorsuppressor ist, da eine Verringerung der Expression um 50% die Entstehung von Tumoren fördert. CHK1 ist ein essentielles Gen und homozygoter Verlust ist daher sehr früh letal in der Embryonalentwicklung von Mäusen. In Krebszellen ist CHK1 jedoch ebenso wichtig, da sich Krebszellen meist extrem schnell teilen und CHK1 Fehler bei der Zellteilung verhindert. <br />Diese Arbeit fasst die letzten fünf Jahre meiner Forschung an CHK1 und seiner Rolle (1) in der B-Zellentwicklung und dem Überleben von Krebszellen, (2) im Aufbau und Erhalt des hämatopoetischen Systems und (3) einem speziellen Zelltodmechanismus, dem „CHK1-suppressed (CS) cell death pathway“, zusammen. Ich konnte dabei zeigen, dass CHK1 essentiell für die B-Zellentwicklung, für die Tumorentstehung und das Überleben von Tumorzellen, speziell im Kontext von deregulierter Expression des Onkogens MYC, ist. Das deutet auf eine per se Tumor-fördernde (onkogene) Funktion von CHK1 hin. Darüber hinaus führt CHK1-Defizienz zu einem Block der B-Zellentwicklung im Pro-B Zellstadium, welcher auch nicht überwunden werden kann wenn Apoptose blockiert wird, obwohl primäre Zellen dadurch zumindest kurzfristig von Zelltod bewahrt wurden. Stattdessen konnten wir beobachten, dass diese Zellen ihren Zellzyklus anhalten und somit verhindern, dass sich Fehler im Genom verbreiten, welche zwangsläufig in der Abwesenheit von CHK1 entstehen. Zudem konnten wir zeigen, dass, abhängig vom p53-Status, Zellen nach CHK1 Inhibition polyploid werden, was einen ersten Schritt in Richtung Aneuploidie darstellen kann. Zusammengefasst zeigt unsere Forschung, dass CHK1-Inhibitoren zwar effizient gegen verschiedene Tumorarten, die das hämatopoetischen System betreffen und speziell jene die MYC deregulieren, eingesetzt werden könnten, doch dass es einige Schwierigkeiten aufgrund von starken Neben-wirkungen auf Nicht-Tumorzellen geben könnte.<br />Parallel dazu untersuchten wir den Effekt von CHK1-Defizienz in der Ausbildung des hämatopoetischen Systems. Hier konnten wir zeigen, dass das hämatopoetischen System in Abwesenheit von CHK1 nicht gebildet werden kann und dass Embryonen ungefähr zu dem Zeitpunkt der Etablierung des Systems in utero sterben. Die hämatopoetischen Stammzellen (HSZ), die wir aus der embryonalen Leber, dem Ort der Hämatopoese in der Embryonalentwicklung, isolieren konnten, fehlte in Abwesenheit von Chk1 das Potential Kolonien zu bilden und somit die Fähigkeit ein hämatopoetisches System aufzubauen. Als Ursache wurde das Fehlen von Langzeit-HSZ erkannt. Dieser Phänotyp konnte weder durch gleichzeitigen Verlust von p53 und/oder caspase-2 oder der Überexpression von anti-apoptotischem BCL2 nicht verhindert werden. Auch humane Stammzellen aus der Nabelschnur verloren ihre koloniebildenden Eigenschaften nach Behandlung mit dem CHK1-Inhibitor PF-477736, was darauf hinweist, dass auch humane HSZ CHK1 brauchen um ein hämatopoetisches System aufzubauen. <br />Schlussendlich untersuchten wir einen alternativen Zelltod-Signalweg, der unter bestimmten Bedingungen von caspase-2 exekutiert und normalerweise von CHK1 unterdrückt wird. Normalerweise sterben Zellen, die beispielsweise ionisierender Strahlung ausgesetzt waren und dadurch starke DNA-Schäden aufweisen, durch Apoptose. Dieser Prozess wird induziert durch p53, welches oft in verschiedenen Krebstypen mutiert ist. Wenn aber zusätzlich CHK1 inhibiert wird, können p53-defiziente Zellen durch die Aktivierung des „CS-pathway“ über caspase-2 sterben: Diese Beobachtung konnten wir aber nur zum Teil in humanen Krebszelllinien, aber nicht in Mäusen reproduzieren. Daher schließen wir, dass dieser Signalweg nicht generell gültig sein kann und in diese Richtung noch weitere Forschung nötig ist um eine klare Aussage treffen zu können.

eng: Checkpoint kinase 1 (CHK1) is critical for intrinsic cell cycle control and coordination of cell cycle progression in response to DNA damage. However, targeting CHK1 has been identified as a potential means to kill cancer cells, in particular those lacking the tumor suppressor p53. A number of new generation compounds have been developed and are tested in pre-clinical models and early clinical trials. Yet, as Chk1 is an essential gene, little information is available about its role in normal physiology. Studies using Chk1 haplo-insufficient cells or animals suggested a role as tumor suppressor, in line with its function to halt cell cycle progression and orchestrate DNA repair in response to replication stress or when cells experience exogenous DNA damage. Yet, in cancer cells CHK1 appears to display pro-survival properties, suggesting context dependent activities.<br />This thesis summarizes the work of the last five years, where I was focusing on the role of CHK1 (1) in B-cell development and cancer cell survival, (2) in the establishment and maintenance of the hematopoietic system and (3) in the CHK1-suppressed (CS) cell death pathway. In short, we could show that CHK1 is essential for B cell development and MYC-driven transformation as well as lymphoma cell survival, in support of a per se oncogenic pro-survival function of this kinase. Ablation of CHK1 in B cells arrests their development at the pro-B cell stage, a block that cannot be overcome by inhibition of mitochondrial apoptosis that transiently blocked cell death of primary cells treated with a CHK1-inhibitor. Instead, cell cycle arrest is initiated as an alternative fate to limit the spread of damaged DNA. Impaired checkpoint function in apoptosis-resistant cells, however, facilitates – depending on the p53-status – polyploidization, a first step towards aneuploidy. Together, our findings suggest that targeted CHK1 inhibition might be an effective means to treat blood cancers associated with MYC overexpression, yet, given its essential role in normal B cell development, its impact on normal hematopoiesis may severely limit immune competence during therapeutic use.<br />In parallel, we also assessed the effect of CHK1-depletion on the entire hematopoietic system. Genetic deletion of CHK1 in hematopoietic stem cells in utero resulted in embryonic lethality roughly around the time when the hematopoiesis becomes rate limiting for the survival of the embryo. We could show that deletion of CHK1 in the hematopoietic system using a floxed allele of Chk1 and Cre-recombinase driven from the Vav-gene promoter results in the death of hematopoietic cells in the fetal liver that is responsible for the embryonic lethality of these embryos. Hematopoietic stem cells (HSC) isolated from the fetal liver of CHK1-deleted embryos lacked colony formation potential, which can be explained by the lack of long-term HSC that were found in these mice. Furthermore, we could show that cell death inflicted by loss of CHK1 cannot be prevented by concomitant loss of p53 and/or caspase-2 or by overexpression of BCL2. Similarly, cord-blood derived CD34+ human hematopoietic stem cells treated with PF-477736, a highly specific CHK1 inhibitor, lose colony formation potential and therefore the ability to build up the hematopoietic system.<br />Last but not least, we aimed to test the cross-species conservation of the CHK1-suppressed cell death pathway. Normally, cells die in response to severe DNA damage induced by irradiation via p53, which is often mutated in human cancer. However, when CHK1 function is blocked, cells lacking p53 have an alternative route to death that is executed by the protease caspase-2. In brief, we could confirm the relevance of this signaling pathway in human cancer cell lines, but not in murine cells or in vivo in gene-modified mice. Therefore, we state that, at least in our hands, there is no general applicability of the CS-pathway and further research in this direction is needed.