Temporary adhesion and regeneration in the marine flatworm Macrostomum lignano / submitted by Birgit Lengerer

• VerfasserIn: Lengerer, Birgit
• Place / Publishing House: Innsbruck, February 2017
• Year of Publication: 2017
• Language: English
• Classification: 42.13 - Molekularbiologie; 42.76 - Plathelminthes. Aschelminthes. Nemertini; 42.62 - Tiermorphologie. Tieranatomie
• Physical Description: 6 ungezählte Blätter, 179 Blätter; Illustrationen; 30 cm
• Notes: Kumulative Dissertation aus vier Artikeln; Zusammenfassung in deutscher Sprache

ger: Diese Dissertation konzentriert sich auf zwei bemerkenswerte Fähigkeiten des frei lebenden, marinen Plattwurmes Macrostomum lignano: temporäre Adhäsion und Regeneration. Der erste Teil widmet sich der Charakterisierung seiner Klebeorgane, die es dem Tier ermöglichen sich wiederholt anzuhaften und wieder loszulösen. Der zweite Teil ist auf die Untersuchung der schnellen Regeneration ganzer Organe und Gewebe gerichtet, wobei der Schwerpunkt auf der Regeneration von den Klebeorganen und dem posterioren Bereich des Tieres liegt.<br />Marine Klebstoffe sind eine vielversprechende Vorlage für die Entwicklung von biokompatiblen Klebstoffen für den medizinischen Bereich. Allerdings wurden bisher nur wenige natürliche Klebstoffsysteme charakterisiert. Macrostomum lignano kann sich innerhalb von einer Minute mehrmals am Substrat anhaften und wieder loslösen. Diese reversible Adhäsion beruht auf Klebeorganen, die aus drei Zelltypen bestehen: einer Klebezelle, einer Loslöszelle, und einer Ankerzelle. In dieser Arbeit präsentiere ich die detaillierte Morphologie der Klebeorgane und zeige, dass die strukturelle Integrität der Ankerzelle für den temporären Anhaftungsprozeß wesentlich ist. Wir identifizierten ein Strukturprotein, Macif1, das ausschließlich in den Ankerzellen exprimiert wird. RNA-Interferenz vermittelter Knock-down führte zu dem ersten experimentell induzierten nicht klebenden Phänotyp in einem marinen Tier.<br />Als nächstes charakterisierten wir die Regeneration von Klebeorganen nach verschieden Amputationsebenen. Um geeignete Marker für Klebeorgane zu identifizieren, haben wir 15 handelsübliche Lectine getestet. Ein Lectin (Erdnuss-Agglutinin) war spezifisch für die Vesikel der Klebezelle. Wir verwendeten Lektin- und Antikörper-Färbung sowie Transmissionselektronenmikroskopie um die Morphologie der regenerierenden Klebeorgane zu visualisieren. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die beiden Drüsenzellen früher als die verbundene Ankerzelle differenzieren. Mit Hilfe von EdU- und Lektinfärbungen von teilweise amputierten Klebeorganen zeigten wir, dass ihre Regeneration auf zwei Arten erfolgen kann. Erstens können die Zellkörper der Klebezelle partielle Amputationen überleben und sich wieder mit neu gebildeten Ankerzellen zu verbinden. Zweitens werden verletzte Klebezellen abgebaut und das gesamte Klebeorgan neu gebildet. Zusätzlich zu den Hauptexperimenten, entdeckten wir mittels Lectinfärbungen vier neue Drüsen im vorderen Bereich der Tiere.<br />Um organspezifische Expression im posterioren Bereich von Macrostomum lignano zu charakterisieren, wurde ein in situ Hybridisierungs Screen durchgeführt. Wir beschreiben 111 Transkripte, die im Antrum, den Zementdrüsen, den Klebeorganen, den Prostatadrüsen, den Rhabditdrüsen und anderen Geweben exprimiert werden. Als nächstes verwendeten wir RNA-Sequenzierung, um zeitliche Expressionsniveaus in der regenerierenden Schwanzplatte zu entschlüsseln. Dabei entdeckten wir drei nicht annotierte Gene, die ausschließlich im regenerierenden Stilett exprimiert werden. RNA-Interferenz zeigte, dass diese Gene für die Bildung des gesamten männlichen Kopulationssystems erforderlich sind.<br />Unser in situ Hybridisierungs Screen zeigte, dass einzelne Färbungen nicht immer ausreichend sind, um bestimmte Zelltypen zu unterscheiden. Zum Beispiel sind die Zellkörper der Klebe- und Loslösezellen in unmittelbarer Nähe und Färbungen führen zu einem ähnlichen Expressionsmuster bei beiden Zelltypen. Aus diesem Grund entwickelte ich ein Protokoll für die doppelte, fluoreszierende in situ Hybridisierung in Macrostomum lignano. Mit dieser Methode konnten wir zwischen drei Zelltypen von Zementdrüsen unterscheiden, die verschiedene Expressionsmuster aufweisen. Weiterhin ermöglichte die Gegenfärbung einer fluoreszierenden in situ Hybridisierung mit einem Lectin, zwischen der Expression in Klebe- und Loslöszellen zu unterscheiden.<br />Zusammenfassend wird ein umfangreicher Datensatz von morphologischen Analysen und Expressionsmustern während Homöostase und Regeneration präsentiert. Die Ergebnisse ebnen den Weg für ein besseres Verständnis von temporärer Adhäsion und Organogenese.

eng: This PhD thesis is focused on two remarkable abilities of the free-living, marine flatworm Macrostomum lignano: temporary adhesion and regeneration. The first part is dedicated to the characterization of its elaborate adhesive system that allows the animal to attach and release repeatedly. The second part is directed at the investigation of the fast regeneration of whole organs and tissues, with focus on the regeneration of adhesive organs and the posterior region. <br />Marine adhesives are a promising source for biomedical applications. However, only few natural adhesive systems have been investigated so far. Macrostomum lignano is able to attach itself to the substrate several times within a minute. This reversible adhesion relies on adhesive organs comprised of three cell types: an adhesive gland cell, a releasing gland cell, and an anchor cell, which is a modified epidermal cell responsible for structural support. In this thesis I present the detailed morphology of the adhesive organs and demonstrate that the structural integrity of the anchor cell is essential for the temporary adhesion process. We identified an intermediate filament gene, macif1, which is expressed in the anchor cells. RNA interference mediated knock-down resulted in the first experimentally induced non-adhesion phenotype in any marine animal. <br />Next, we characterized the regeneration of adhesive organs upon different amputation sites. To identify suitable markers for adhesive organ specific cells, we tested 15 commercially available lectins for their ability to label adhesive organs. One lectin (peanut agglutinin) was specific to adhesive gland cell vesicles. We visualized the morphology of regenerating adhesive organs using lectin- and antibody staining as well as transmission electron microscopy. Our findings indicate that the two gland cells differentiate earlier than the connected anchor cells. Using EdU/lectin staining of partially amputated adhesive organs, we showed that their regeneration can proceed in two ways. First, adhesive gland cell bodies are able to survive partial amputation and reconnect with newly formed anchor cells. Second, adhesive gland cell bodies are cleared away, and the entire adhesive organ is build anew. Additionally, the lectin labelling revealed four new gland types in the anterior region of the animals.<br />To identify organ-specific transcripts in the posterior region of Macrostomum lignano, we performed a medium-scale in situ hybridization (ISH) screen. We described 111 transcripts expressed in the antrum, cement glands, adhesive organs, prostate glands, rhabdite glands, and other tissues. Next, we used RNA sequencing to characterize temporal expression levels in the regenerating tail plate. We identified three not annotated genes that are solely expressed in the regenerating stylet. RNA interference showed that these genes are required for the formation of not only the stylet, but the whole male copulatory apparatus. <br />Our in situ hybridization screen revealed that single ISH is not always sufficient to distinguish certain cell types. For example the adhesive- and releasing gland cells are present in close proximity and single ISH leads to a similar expression pattern for both cell types. For this reason I developed a protocol for double fluorescent in situ hybridization in Macrostomum lignano using a tyramide signal amplification (TSA) system. Using this method we were able to distinguish between three expressional different cell types of cement glands. Furthermore, the counterstain of a fluorescent ISH with an adhesive gland cell specific lectin enabled to distinguish between the expression within adhesive- and releasing gland cells. <br />In summary, the results provide a large resource of morphological and expression data during homeostasis and tail regeneration and pave the way for a better understanding of temporary adhesion and organogenesis.