Functional genomics and drug mechanism-of-action in breast cancer and beyond / submitted by Barbara Mair

• VerfasserIn: Mair, Barbara
• Place / Publishing House: Vienna, Oxford, November 2016
• Year of Publication: 2016
• Language: English
• Classification: 42.15 - Zellbiologie; 44.48 - Medizinische Genetik; 42.13 - Molekularbiologie
• Physical Description: XXIV, 139 Seiten; Illustrationen
• Notes: Zusammenfassung in deutscher Sprache; Abweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des Verfassers

ger: Krebs ist eine heterogene Krankheit, der in den meisten Fällen Mutationen zu Grunde liegen, die Onkogene ein- oder Tumorsuppressoren ausschalten. Daher wird Krebs auch als genetische Krankheit bezeichnet.<br />Brustkrebs wird nach histologischen und genetischen Kriterien in mehrere Subtypen eingeteilt. Für dreifach-negativen Brustkrebs (triple-negative breast cancer, TNBC), der oft auch als basal bezeichnet wird und die klinisch aggressivste Form darstellt, gibt es keine personalisierte Behandlung. TNBC ist genetisch besonders uneinheitlich, daher ist die Entwicklung zielgerichteter Therapien anhand von genetischen Biomarkern schwierig. Daher versuchten wir, den basalen Grundstatus der Brustkrebszellen anzugreifen. Dazu exprimierten wir den Transkriptionsfaktor TWIST1 in Brustepithelzellen, was einen basal-ähnlichen Zustand hervorruft. Dieses Modellsystem setzten wir 20000 chemischen Substanzen aus und fanden heraus, dass Midostaurin, ursprünglich als Inhibitor der Proteinkinase C (PKC) entwickelt, gezielt basale, aber nicht luminale Brustkrebszellen angreift. Mittels bioinformatischer Netzwerkanalyse und Chemoproteomik konnten wir Aurora Kinase A und SYK als relevante Zielproteine identifizieren.<br />Der Hauptteil dieser Arbeit beschäftigt sich mit häufigen Brustkrebsmutationen und ihrer Verteilung. Nur vier Gene sind in mehr als 10% der Brustkrebspatientinnen verändert, drei davon (PIK3CA, TP53 und CDH1) sind bereits ausführlich charakterisiert. Das vierte Gen, GATA3, ist ein Transkriptionsfaktor, der in der Differenzierung der Brustdrüsen während der Pubertät eine essenzielle Rolle spielt und für die Beibehaltung einer luminalen Zellidentität sorgt. Wir führten eine bioinformatische Analyse durch, bei der wir Genexpressionsveränderungen mit Mutationspositionen in Verbindung setzten, um einen Einblick zu gewinnen, welche Mutationen an welcher Stelle funktionelle Auswirkungen haben. GATA3 zeigte mit Abstand die meisten positionsabhängigen Genexpressionsveränderungen. Wir fanden zwei funktionell unterschiedliche Mutationsklassen: ein verkürztes und ein verlängertes Protein. Letzteres korreliert mit kürzerer progressionsfreier Überlebenszeit in Patientinnen. Wir untersuchten die beiden GATA3-Varianten mit Hilfe eines Zellmodells. Während das verkürzte Protein seine Funktion verliert, deutet die Extension auf eine gesteigerte oder veränderte Aktivität hin. Darüber hinaus stellten wir fest, dass die Präsenz des verlängerten Proteins die Sensitivität von Brustepithelzellen gegenüber Inhibitoren der Histonmethyltransferasen G9A und GLP drastisch erhöht. <br />Auch epigenetische Mechanismen tragen wesentlich zur Krebsentstehung bei, oft durch Mutationen in Enzymen, die die Zugänglichkeit der DNA regulieren. Dies geschieht durch posttranslationale Modifikationen an Histonproteinen. Histondemethylasen (KDMs) beseitigen Methylgruppen und aktivieren oder inaktivieren so die Transkription bestimmter Gene. Um die Funktionen dieser Enzyme studieren zu können, ist es hilfreich, sie mithilfe chemischer Substanzen zu inhibieren. Der dritte Teil dieser Arbeit beschreibt die Entwicklung eines spezifischen, zellaktiven Inhibitors für KDM2A. Ein multidisziplinäres Forscherteam synthetisierte eine Serie neuartiger KDM2A-Inhibitoren, die nicht mit den enzymatischen Kofaktoren Eisen und Alphaketoglutarat kompetitieren. Wir führten in weiterer Folge zelluläre Experimente durch, um ihre Toxizität und Aktivität innerhalb der Zelle festzustellen. Der beste Inhibitor ruft in nicht-toxischer Konzentration spezifische Änderungen in der Genexpression hervor. In höherer Konzentration kommen unspezifische Effekte hinzu.<br />In diesen drei methodisch und inhaltlich verschiedenen Studien stehen Gen-Wirkstoff-Interaktionen in Brustkrebs und darüber hinaus im Mittelpunkt, die einen Beitrag zum Fortschritt personalisierter Medizin in der Krebsbehandlung leisten könnten.

eng: Cancer is a heterogeneous disease characterised by a set of hallmarks. The main underlying causes for acquisition of these are mutations that switch oncogenes on or tumour suppressors off. Hence, cancer is in essence a genetic disease.<br />Breast cancer can be grouped into molecular subtypes according to genetic, histological and gene expression profiling. No targeted therapy has been approved for triple negative breast cancer (TNBC, also termed basal-like). Hence, patients diagnosed with this aggressive subtype have the worst prognosis and are left with chemo- and radiotherapy. Genetically, TNBC is particularly diverse, posing a major challenge for the development of targeted therapeutic agents based on genetic biomarkers. We therefore aimed at targeting the basal-like cell state of TNBCs instead of an individual mutant protein. We expressed the transcription factor TWIST1 in breast epithelial cells to induce a basal-like state. We screened these cells against 20,000 chemical compounds and found that the protein kinase C inhibitor midostaurin is specifically toxic to basal but not luminal cells. Since midostaurin is a compound with a broad target spectrum, we performed chemical proteomics and computational network modelling to identify AURKA and SYK as the relevant basal-specific targets. Independent inhibitors of these kinases recapitulated the selective toxicity and acted in a synergistic manner.<br />The main part of this thesis focuses on recurrent breast cancer mutations and their distribution within a gene. Only four genes are mutated in more than 10% of breast cancer patients, three of which (PIK3CA, TP53 and CDH1) are well characterised. The fourth gene, GATA3, is a transcription factor that plays an essential role in differentiation of the mammary epithelium and maintains its luminal identity. In order to study the functional impact of mutations in particular regions of the gene, we performed a bioinformatics analysis on patient data, correlating changes in gene expression with mutation position. GATA3 by far displayed the highest number of such position-dependent expression changes, revealing two functionally different mutation classes that result in either a truncated or an extended protein. GATA3 extension mutations correlate with decreased disease-free survival in breast cancer patients. We investigated these GATA3 variants in a cell line model and could recapitulate the functional differences there, indicating a loss-of-function of the truncated protein, but a gain-of-function of elongated GATA3. Furthermore, we found that GATA3 extension but not truncation mutations render cells specifically sensitive to inhibition of the histone methyltransferases G9A and GLP.<br />Epigenetic mechanisms also contribute to tumourigenesis, often through mutations in enzymes regulating DNA accessibility and gene expression. This regulation occurs by posttranslational modifications on histone proteins. Histone demethylases (KDMs) are enzymes removing methyl groups to activate or inactivate transcription of target genes. In order to study these enzymes, chemical probes to inhibit their activity are helpful tools. The third part of this thesis describes the development of a selective, cell-active KDM2A inhibitor. A multidisciplinary research team synthesised a series of molecules that bind non-competitively with the cofactors iron and 2-oxoglutarate and tested them for potency and selectivity in vitro. We then investigated the cellular activity and toxicity of the most promising candidates and could show that the best molecule elicited a specific transcriptional response at a non-toxic concentration, whereas unspecific effects are observed at higher concentrations.<br />This thesis comprises three methodically and thematically different studies that centre around gene-drug interactions in breast cancer and beyond. Such, all three studies could potentially contribute to the progress of personalised medicine in cancer treatment in different ways.