Native chemical ligation of hydrolysis-resistant 3'-peptidyl-tRNA mimics / Anna-Skrollan Geiermann

• VerfasserIn: Geiermann, Anna-Skrollan
• Place / Publishing House: 2012
• Year of Publication: 2012
• Language: English
• Classification: 35.62 - Aminosäuren. Peptide. Eiweiße; 35.65 - Nukleinsäuren
• Physical Description: IX, 304 S.; Ill., graph. Darst.
• Notes: Enth. u.a. 7 Veröff. d. Verf. aus den Jahren 2009 - 2012 . - Zsfassung in dt. Sprache

ger: Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurde eine Methode entwickelt um hydrolyseunempfindliche 3'-Peptidyl-RNA-Konjugate zu synthetisieren, welche Aminosäuren mit komplexen Seitengruppenfunktionalitäten, wie zum Beispiel Arginin, besitzen. Der ausgearbeitete neuartige Ansatz verbindet Festphasensynthese und Biokonjugation um diese Verbindungen mit hoher Effizienz und Reinheit zu erhalten.<br />Hydrolyseunempfindliche 3'-Peptidyl-RNA-Konjugate sind sehr wichtige Verbindungen für strukturelle und funktionelle Untersuchungen des Ribosoms, da sie als Mimetika für acylierte tRNA-Enden fungieren und anstelle der natürlichen hydrolyse-unbeständigen 3'-Esterbindung eine stabilere Amidbindung zwischen dem 3' terminalen Adenosin (A76) der tRNA und der C terminalen Aminosäure der Peptidkette besitzen. In ihrer einfachsten Form werden solche Konjugate durch das natürlich vorkommende Antibiotikum Puromycin und seine Derivate vertreten. Diese wurden als stabile Substrate im Peptidyl-Transferase-Zentrum des Ribosoms positioniert und trugen basierend auf hochauflösenden Röntgenstrukturen ausschlaggebend zu detaillierten mechanistischen Erkenntnissen zur Knüpfung der Peptidbindung bei. Durch einen experimentell einfachen Zugang zu dieser Verbindungsklasse werden daher weitere Untersuchungen und funktionelle Charakterisierungen von unterschiedlichen Zuständen der ribosomalen Translation, insbesondere der Zustände vor und nach der Übertragung der Peptideinheit und der Hybridzustände der tRNA, sowie Initiation der Translation, Elongation und Termination, erhofft.<br />Desweiteren ermöglicht diese Verbindungsklasse die Erforschung von Phänomenen der peptidgesteuerten Makrolidantibiotika-Resistenz.<br />Der Schlüsselschritt in der Synthese dieser hydrolyseunempfindlichen 3'-Peptidyl-RNA-Konjugate ist die native chemische Ligation, welche ursprünglich zur Verknüpfung von ungeschützten Peptidfragmenten unter milden Reaktions-bedingungen entwickelt wurde. Der Prozess der nativen chemischen Ligation beinhaltet eine Reaktion zwischen einem schwach aktivierten C-terminalen Thioester und einem ungeschützten N-terminalen Cysteinrest. Ein Hauptziel war daher die Synthese der zwei neuartigen 3'-Cysteinylamin-3'-deoxyadenosin-modifizierten Festphasenträger für die Standard-Festphasensynthese von Oligonukleotiden. Hierbei ist ein orthogonales Schutzgruppenkonzept für den 3' Cysteinrest wesentlich und es ist nennenswert, dass für jedes 3' Cysteinoligonukleotid die optimalen Entschützungsbedingungen ausgearbeitet wurden. Ein weiteres wichtiges Ziel war die Synthese einer Reihe von Peptidthioestern.<br />Zunächst wurden normale Benzylthioester für die native chemische Ligation mit 3'-Cysteinyl-RNA-Fragmenten verwendet, jedoch erwies sich deren eingeschränkte Löslichkeit als limitierend für einen effizienten Einsatz. Daher wurden aminomodifizierte Benzylthioester mit einer erhöhten Löslichkeit in wässrigen Puffersystemen synthetisiert. Mit den somit vorliegenden 3'-Cysteinyl-RNA- und Peptidthioesterfragmenten wurden anschließend die Reaktionsbedingungen für die native chemische Ligation ausgearbeitet und optimiert. Das Produktkonjugat, 3'-Peptidyl-RNA, wurde mittels Anionenaustausch-HPLC gereinigt und aufgrund der leicht oxidierenden HPLC Pufferbedingungen als Disulfid-verknüpftes Homodimer isoliert.<br />Um die Sequenzvielfalt von 3'-Peptidyl-RNA-Konjugaten zu erweitern, wurde die selektive Entschwefelung des Cysteinrestes zu Alanin unter den metallfreien, auf Radikale basierenden Bedingungen erarbeitet.<br />Zusammenfassend stellt dieser neuartige Ansatz, welcher auf chemischer Ligation basiert, einen effizienten Zugang zu hydrolyseunempfindlichen, biologisch aktiven 3' Peptidyl-tRNA Mimetika dar. Der Vorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass jedes Biomolekül - Oligonukleotid und Peptid - gesondert durch Festphasensynthese dargestellt wird und nach Abspaltung und Entschützung können diese in Lösung durch die chemoselektive Reaktion native chemische Ligation miteinander verknüpft werden. Unter der Verwendung von nativer chemischer Ligation wird eine höhere Seitenkettenflexibilität erreicht und größere Konjugate sind zugänglich. Diverse 3'-Peptidyl-tRNA-Mimetika wurden im Rahmen dieser Dissertation auf diese Weise synthetisiert. Manche von diesen Konjugaten gleichen in ihrer Struktur bekannten Resistenzpeptiden, welche die Wirkung von Markolidantibiotika am Ribosom über einen bisher unbekannten ribosomalen Translationsmechanismus aufheben können. Nun steht der Weg zu weiteren strukturellen und funktionellen Untersuchungen des Ribosoms unter Verwendung von 3'-Peptidyl-tRNA-Mimetika offen, um Aufschluss über dieses spezielle Phänomen der Antibiotikaresistenz sowie auch über die allgemeinen Wechselwirkungen der Peptidkette im ribosomalen Tunnel zu geben.<br />

eng: Within the framework of this thesis, a method for the synthesis of hydrolysis-resistant 3'-peptidyl-RNA conjugates that contain amino acids with complex side chain functionalities, such as arginines, was developed. The elaborated novel approach combines solid-phase synthesis and bioconjugation to obtain these derivatives with high efficiency and purity. Hydrolysis-resistant 3'-peptidyl-RNA conjugates are highly requested compounds for structural and functional studies of the ribosome because they mimic acylated tRNA termini and comprise instead of the natural hydrolysis-labile 3'-ester bond the more stable amide linkage between the 3'-terminal tRNA adenosine (A76) and the C terminal amino acid of the peptide chain. In their simplest form such conjugates are represented by the naturally occurring antibiotic puromycin and its derivatives which were positioned as stable substrates in the peptidyl transferase center of the ribosome and gave rise to detailed mechanistic insights into ribosomal peptide bond formation based on high-resolution X-ray structures. Therefore, facile experimental access to this type of conjugate is expected to stimulate further investigations and functional characterizations of different states of ribosomal translation, in particular of pre- and post-peptidyl transfer states and tRNA hybrid states as well as translation initiation, elongation, and termination.<br />In addition, such conjugates will enable the exploration of peptide-mediated macrolide antibiotic resistance phenomena.<br />The key step in the preparation of these hydrolysis-resistant 3'-peptidyl-RNA conjugates is native chemical ligation which was originally designed to link unprotected peptide fragments under mild conditions. The process of native chemical ligation involves a reaction between a weakly activated C-terminal thioester and an unprotected N-terminal cysteine residue. Therefore, on one hand a major aim was the synthesis of the two novel 3'-cysteinylamino-3'-deoxyadenosine-modified solid supports for standard oligonucleotide solid-phase assembly.<br />Noteworthy, an orthogonal protecting group concept was essential for the 3'-cysteine moiety and the optimal deprotection conditions had to be elaborated for every 3' cysteinyloligonucleotide. On the other hand, a major goal was the preparation of a series of peptide thioesters.<br />Initially, standard benzylthioesters were used for native chemical ligation with 3'-cysteinyl-RNA fragments; however their limited solubility restricted their efficient application. Therefore, amino-modified benzylthioester peptides with an increased solubility in aqueous buffer were synthesized. Having the 3'-cysteinyl-RNA and peptide thioester fragments in hand, the reaction conditions for native chemical ligation were elaborated and optimized. The product 3'-peptidyl-RNA conjugates were purified by anion-exchange HPLC and isolated as disulfide-bridged homodimers due to the slightly oxidizing HPLC buffer conditions.<br />To extend the sequence variety of 3'-peptidyl-RNA conjugates obtained by native chemical ligation, selective desulfurization of the cysteine-moiety to alanine under metal-free, radical-based conditions was developed.<br />In conclusion, this novel approach creates efficient access to hydrolysis-resistant, biologically active 3'-peptidyl-tRNA mimics. The advantage of this approach is that each biomolecule - oligonucleotide and peptide - is assembled separately by solid-phase synthesis and after cleavage and deprotection they can be joined together in solution by the chemoselective reaction of native chemical ligation. With the use of native chemical ligation, greater side chain flexibility is achieved and larger conjugates are accessible.<br />Various 3'-peptidyl-tRNA mimics were synthesized along these lines within the framework of this thesis. Some of these conjugates relate to known resistance peptides that can render the ribosome resistant to certain macrolide antibiotics by a yet unknown ribosomal translation mechanism. Now structural and functional studies of the ribosome with these 3'-peptidyl-tRNA mimics are awaited to shed more light on that specific antibiotic resistance phenomenon as well as on the general interactions of the peptide chain in the ribosomal tunnel.