Assessment of de novo mutations in meiotic recombination products / Author Barbara Arbeithuber

• VerfasserIn: Arbeithuber, Barbara
• Place / Publishing House: Linz, 2016
• Ano de Publicação: 2016
• Idioma: English
• Classification: 42.13 - Molekularbiologie; 42.20 - Genetik; 42.21 - Evolution
• Descrição Física: Getrennte Zählung; Illustrationen
• Observações: Zusammenfassung in deutscher Sprache; Teil davon erschienen in: Proc Natl Acad Sci U S A.: Crossovers are associated with mutation and biased gene conversion at recombination hotspots, 2015, 112(7): p. 2109-14 / http://www.pnas.org/content/112/7/2109.short
• Resumo: eng: Changes in DNA sequences – mutations – are generally known to play an importation role in a wide range of biological processes including evolution, but also diseases (e.g. cancer) and aging. Especially mutations in the germline (sperm or eggs) constitute a special type of mutations since they directly influence the next generations. Current theories of evolution assume that heritable mutations arise spontaneously in our germline and are distributed randomly across our genome. Yet, mechanisms such as meiotic recombination, might drive a local increase of mutations in regions with high recombination activity. Meiotic recombination occurs in localized regions of the genome, known as recombination hotspots. A correlation of an increased diversity and divergence in regions with high recombination activity has been shown previously, suggesting that recombination could be mutagenic. But before this work, no experimental evidence existed in humans proofing an increased mutagenic activity with meiotic recombination. Thus, the major objective of this doctoral thesis was to accurately assess whether recombination hotspots also harbor mutational hotspots in humans. In order to detect mutations, single recombination products (crossover products) with an exchange of paternal and maternal DNA were collected. Pooled sperm typing, a method based on allele-specific DNA amplification, was used to collect these single crossover products from human sperm DNA, which were then analyzed for de novo mutations by standard capillary Sanger sequencing. This method was based on the selective (allele specific) amplification of single crossovers out of a pool of non-recombinant DNA molecules for a selected recombination hotspot. Therefore, it was essential to identify informative donors (having two pairs of heterozygous single nucleotide polymorphisms (SNPs) flanking the recombination hotspot) and asses the phase of the heterozygous alleles (haplotype) within the homologs prior to crossover collection. Furthermore, in the analysis of low-frequency mutations, a special focus was put in the detection and avoidance of false positive mutations (artifacts), biasing the sequencing results. Therefore, in addition to the assessment of mutations in single crossovers, a fair number of non-recombinant molecules was analyzed in order to obtain a background mutation frequency and to assess the methodology associated errors. During my thesis I also analyzed the source of different artifacts in detail and tested methods for their reduction. Based on these results, an enzymatic method was implemented to reduce artifact formation resulting from the most common DNA lesions, uracil and 8 oxoguanine, and extensive heat treatments were avoided during DNA preparation used to collect crossovers. <br />Under these considerations, we collected male crossover products and found significantly more mutations in crossovers compared to non-recombinant controls. A comparison to the genome wide mutation rate showed, that the mutation rate at hotspots was significantly increased in crossovers. Mutations were mainly in the direction of a strong base (guanine or cytosine) to a weak base (adenine or thymine). The majority of the mutations occurred in the context of a cytosine-guanine dinucleotide (CpG site), in which the cytosine is frequently methylated in the human genome. Analysis of our hotspots and donors showed, that about 85% of the CpG sites were methylated in the pre-meiotic and meiotic products. Additionally to an increased number of mutations, we also identified a non-symmetrical DNA exchange between paternal and maternal chromosomes associated with crossovers (biased gene conversion). In opposition to what we observed for mutations, biased gene conversion favored the transmission of a strong base over a weak one, therefore also referred as GC-biased gene conversion (gBGC). When combining both, mutations and gBGC, gBGC has the stronger effect driving the directionality of the allele frequency. These findings are not only consistent with the observed higher guanine and cytosine contents at recombination hotspots, but also with the idea that gBGC could be an adaptation to counteract the mutational load of recombination. In conclusion, the results of this project provided for the first time experimental verification that recombination is mutagenic in humans. Though only a small piece of complexity of meiotic recombination was addressed, it will help us understanding the bigger picture of what factors influence recombination activity and its evolution.; ger: Veränderungen in DNA Sequenzen - Mutationen - sind dafür bekannt, dass sie an einer Vielzahl an biologischen Prozessen beteiligt sind, unter anderem Evolution und Krankheiten. Insbesondere Mutationen in der Keimbahn (in Spermien und Eizellen) nehmen hierbei eine spezielle Rolle ein, da sie sich direkt auf die nächsten Generationen auswirken. Derzeitige Evolutionstheorien gehen davon aus, dass vererbbare Mutationen spontan in unserer Keimbahn entstehen und zufällig im Genom verteilt sind, unter Umständen könnten aber Mechanismen wie meiotische Rekombination diese Mutationsrate in Regionen mit erhöhter Rekombinationsaktivität lokal erhöhen. Meiotische Rekombination findet in lokalisierten Regionen im Genom statt, auch bekannt als Rekombinationshotspots. Eine Korrelation zwischen einer erhöhten Diversität und Divergenz in Regionen mit hoher Rekombinationsaktivität konnte bereits gezeigt werden, was nahelegt, dass Rekombination mutagen sein könnte. Vor den Ergebnissen im Zuge dieser Doktorarbeit gab es jedoch keine experimentellen Beweise, die einen Zusammenhang zwischen erhöhter Mutationsaktivität im Menschen und meiotischer Rekombination zeigten. Das Hauptziel dieser Doktorarbeit war daher experimentell zu messen, ob Rekombinationshotspots im Menschen gleichzeitig auch Mutationshotspots darstellen. Für die Detektion von de novo Mutationen mussten zuerst einzelne Rekombinationsprodukte gesammelt werden, die einen Austausch zwischen väterlicher und mütterlicher DNA untergangen haben, was mittels „pooled sperm typing“ geschah. Gesammelte Crossover-Produkte wurden anschließend mittels Sanger-Methode sequenziert und auf de novo Mutationen analysiert. Pooled sperm typing basiert auf der selektiven (Allel spezifischen) Amplifikation einzelner Crossover eines ausgewählten Rekombinationshotspot, heraus aus einer Vielzahl an nicht-rekombinanten DNA Molekülen. Dafür müssen jedoch zuvor informative Spender (welche zwei Paare an heterozygoten Einzelnukleotid-Polymorphismen, die den Rekombinationshotspot flankieren, aufweisen) identifiziert werden, ebenso wie die Phase der heterozygoten Allele (Haplotyp) innerhalb der einzelnen homologen Chromosomen. Darüber hinaus muss bei der Analyse seltener Mutationen ein besonderes Augenmerk auf die Detektion und Vermeidung falsch-positiver Mutationen (Artefakte) gelegt werden, welche die Sequenzierergebnisse verfälschen können. Daher war es nötig, auch verschiedene Artefakte im Detail zu analysieren, und Methoden zu deren Reduktion zu testen. Basierend auf diesen Resultaten konnte eine enzymatische Methode zur Reduktion von Artefakt-Bildungen aufgrund der am häufigsten vorkommenden DNA Läsionen, Uracil und 8 Oxoguanin, implementiert werden, und darüber hinaus wurden extensive Hitze-Behandlungen während der Probenvorbereitung vermieden. <br />Unter Berücksichtigung dieser Aspekte konnten wir rund 6,000 männliche Crossover Produkte sammeln und mittels Sequenzierung der Hotspot Regionen analysieren. Wir fanden eine signifikant höhere Anzahl an Mutationen in Crossover als in nicht-rekombinanten Kontrollen. Ein Vergleich mit der Genom-weiten Mutationsrate hat gezeigt, dass auch hier die Mutationsrate in Crossover Hotspots signifikant erhöht war. Die Mutationen waren hauptsächlich in Richtung von einer starken Base (Guanin oder Cytosin), zu einer schwachen Base (Adenin oder Thymin). Die Mehrzahl an Mutationen war im Kontext eines Cytosin-Guanin Dinucleotides (CpG Dinukleotid), wo das Cytosin im menschlichen Genom häufig methyliert ist. Eine Analyse der untersuchten Hotspot Region und Spender hat gezeigt, dass ungefähr 85% aller CpG Dinukleotide methyliert waren. CpG Dinukleotide haben generell hohe Mutationsraten aufgrund von spontaner hydrolytischer Deaminierung methylierter Cytosine, welche dadurch Thymine bilden. Zusätzlich zu einer erhöhten Anzahl an Mutationen fanden wir einen mit Crossover assoziierten, nicht-symmetrischen DNA Austausch zwischen väterlichen und mütterlichen Chromosomen („biased gene conversion“). Entgegengesetzt zu dem was wir für Mutationen beobachtet haben, passierte die Transmission hier bevorzugt von starken Basen, und wird daher als GC biased gene conversion (gBGC) bezeichnet. Simulationen haben gezeigt, dass wenn man beide Effekte (Mutationen und gBGC) gegeneinander laufen lässt, gBGC als die gewinnende Kraft hervorgeht. Diese Ergebnisse sind nicht nur mit dem höheren Anteil an Guaninen und Cytosinen in Rekombinationshotspots konsistent, sondern auch mit der Idee, dass es sich bei gBGC um eine Adaption handelt, um den Veränderungen durch Mutationen entgegenzuwirken. Die Ergebnisse aus diesem Projekt liefern erstmals eine experimentelle Verifizierung, dass Rekombination im Menschen mutagen ist. Obwohl nur ein kleiner Teil aus dem komplexen Gebiet der meiotischen Rekombination adressiert worden ist, sind diese Ergebnisse hilfreich, um das Gesamtbild, welche Faktoren die Aktivität und Evolution von Rekombination beeinflussen, besser zu verstehen.
• ac_no: AC10778623
• Hierarchical level: Monograph
• Statement of Responsibility: Author Barbara Arbeithuber

eng: Changes in DNA sequences – mutations – are generally known to play an importation role in a wide range of biological processes including evolution, but also diseases (e.g. cancer) and aging. Especially mutations in the germline (sperm or eggs) constitute a special type of mutations since they d...