Advanced synthesis of conjugated metabolites and structural investigations of Fusarium and Alternaria Mycotoxins / von Hannes Mikula

• VerfasserIn: Mikula, Hannes
• Place / Publishing House: 2013
• Year of Publication: 2013
• Language: English
• Classification: 35.52 - Präparative Organische Chemie; 35.63 - Kohlenhydrate; 35.68 - Organische Verbindungen: Sonstiges; 35.06 - Computeranwendungen
• Physical Description: 427, 6 S.; Ill., graph. Darst.
• Notes: Zsfassung in dt. Sprache

ger: Mykotoxine sind von großer Bedeutung für die Agrarwissenschaften, die Lebens- und Futtermittelsicherheit sowie die menschliche Gesundheit im Allgemeinen. Diese von Schimmelpilzen gebildeten toxischen Metabolite kontaminieren weltweit eine Vielzahl von Getreidearten, Obst, Gemüse und auch Tabak und stellen daher ein globales Sicherheitsrisiko dar. Im Fremdstoffmetabolismus einer kontaminierten Pflanze sowie auch bei Tier und Mensch werden Mykotoxine nach der Aufnahme teilweise oder zur Gänze durch (bio)chemische Reaktionen strukturell verändert. Diese Reaktionen sind oftmals jedoch reversibel oder führen zu unverändert toxischen Verbindungen, weshalb die entsprechenden Produkte dieses xenobiotischen Stoffwechsels, sogenannte Phase I und Phase II Metaboliten, nach wie vor in Betracht gezogen und untersucht werden müssen. Vor allem Konjugationsreaktionen in kontaminierten Pflanzen können zu einem großen Anteil an Mykotoxin Metaboliten führen, die bei der Routineanalyse oftmals nicht detektiert werden, weshalb in diesem Zusammenhang der Begriff "maskierte Mykotoxine" in den letzten Jahren zunehmend an Bedeutung gewonnen hat. Für eine exakte Identifizierung und Quantifizierung sowie für die toxikologische Charakterisierung von maskierten und konjugierten Mykotoxinen ist die Verfügbarkeit dieser Metabolite in reiner Form notwendig. Da die Isolierung dieser Verbindungen oftmals nicht oder nur in geringen Mengen möglich ist, mangelt es jedoch an geeigneten Referenzmaterialien für weitere Untersuchungen. Im Rahmen dieser Arbeit sollten daher in erster Linie Methoden zur Synthese von konjugierten Mykotoxinen entwickelt werden, um ausreichende Mengen für weitere Zwecke zu erhalten. Im Speziellen lag der Fokus bei Toxinen, die von Vertretern der Gattungen Fusarium und Alternaria gebildet werden. Ausgehend von einer optimierten Methode zur Synthese von Zearalenon-14-[beta],D-Glucuronid (ZEN-14-GlcA) wurden größere Mengen dieses Konjugats für weitere Untersuchungen hergestellt. Die in vitro Glucuronidierung von ZEN und die bevorzugte Bildung von ZEN-14-GlcA durch hepatische und intestinale Mikrosomen konnte gezeigt werden. Des Weiteren wurde ZEN-14-GlcA als Referenzsubstanz für die Entwicklung einer Multi-Biomarker LC-MS/MS Methode zur verbesserten Expositionsabschätzung herangezogen. Anhand von Modellverbindungen wurde in weiterer Folge ein Verfahren zur Herstellung der Glucoside und Glucuronide der ZEN-Metaboliten [alpha]- und [beta]-Zearalenol entwickelt. Diese Verbindungen konnten durch chemische Glykosylierung von ZEN und anschließende Reduktion sowie Entschützung der Intermediate simultan synthetisiert werden. Aufbauend auf diesen Resultaten wurde in weiterer Folge ZEN-14-[beta],D-Gentiobiosid, als erster synthetischer Dihexosid-Metabolit von Mykotoxinen hergestellt. Für die Synthese von ZEN-Sulfaten wurde eine modulare Synthesestrategie entwickelt, die eine gezielte Herstellung von Mono- und Disulfaten von Resorcylsäurelactonen (RAL) ermöglicht.<br />Zur Synthese maskierter Alternaria-Toxine (Glucoside, Sulfate) wurden entsprechende Derivate von AOH und AME hergestellt und als Ausgangsmaterialien für die gezielte Konjugation verwendet. Durch Entwicklung und Anwendung theoretischer Methoden und Modelle wurden die Strukturen sowie die Chemie von Tenuazonsäure (TeA) sowie der Trichothecen-Metaboliten Pentahydroxyscirpen (PHS) und S-Methyl-Deoxynivalenol (SMD) untersucht. Die exakte Struktur sowie die Tautomerie von TeA wurde mittels quantenchemischer Berechnungen gezeigt bzw. modelliert. Zudem konnte die Synthese von TeA als Beispiel für die wichtige Naturstoff-Klasse der 3-Acyltetraminsäuren modelliert und in silico optimiert werden. Die Struktur des bislang unbekannten Fusarium Metaboliten PHS wurde mittels NMR-Spektroskopie, quantenchemischer Modellierung sowie Kristallstrukturanalyse ermittelt und die Absolutkonfiguration durch diastereoselektive Reduzierung von NIV zu PHS bestätigt. SMD wurde als erster synthetisch zugänglich gemachter Vertreter von Thia-Michael-Addukten von Trichothecenen hergestellt.<br />Anhand dieser Verbindung wurden die strukturellen Eigenschaften, wie zum Beispiel eine spontan ablaufende intramolekulare Hemiketalisierung, sowie die Auswirkung der Adduktbildung auf die Toxizität von Trichothecenen untersucht. Parallel zu den Arbeiten auf dem Gebiet der Mykotoxine wurden neuartige Methoden für die Synthese von Glycosiden entwickelt. Entsprechende Schutzgruppenstrategien wurden erarbeitet und Verfahren zur Herstellung von diastereoselektiven, benzyl-geschützten Glycosyldonoren entwickelt.<br />Diese optimierten Glycosylierungsreagenzien ermöglichen die Synthese von [beta]-konfigurierten Glycosiden ohne die sonst übliche Verwendung von Acylschutzgruppen, deren Abspaltung unter basischen Bedingungen oftmals nicht mit den strukturellen Eigenschaften der Zielverbindung kompatibel ist.<br />

eng: Mycotoxins are of significant importance from an agricultural, economic and health perspective. These secondary metabolites produced by various fungi contaminate cereals, fruits and vegetables worldwide, are responsible for several diseases of economic plants and have been associated with adverse health effects. During xenobiotic metabolism in plants, animals and human, mycotoxins are structurally modified by (bio)chemical reactions. Phase I transformations such as oxidations, reductions or hydrolyses can lead to the formation of equally or even more toxic compounds. Conjugation of mycotoxins with hydrophilic moieties such as glucose, glucuronic acid, sulfate or amino acids and peptides within phase II metabolism, predominantly leads to detoxification, but since these conjugations are often reversible, release of the parent compound after degradation has to be considered. Therefore, compounds that are formed within this metabolism, so-called phase I and phase II metabolites, are of significant importance. Especially conjugation reactions in contaminated plants can lead to an elevated level of metabolites that are not detected applying routine analytical methods, which is why these masked mycotoxins gained more and more attention during the last decades. Human and animal metabolites such as glucuronides are often referred to as conjugated mycotoxins. Apart from investigations towards a better understanding of the metabolism of mycotoxins, these compounds can be applied for the development of reliable biomarker methods for a proper exposure assessment.<br />In terms of the identification and quantification as well as toxicological investigations of masked and conjugated mycotoxins, the availability of these metabolites in pure form is crucial. Due to the difficult or even impossible isolation of these compounds from biological samples, reference materials are still scarce. In the course of this thesis novel methods should be developed for the synthesis of reasonable amounts of conjugated mycotoxins for further investigations, focusing on Fusarium and Alternaria toxins, such as zearalenone (ZEN) and zearalenol (ZEL) as well as alternariol (AOH), alternariol-9-methyl ether (AME) and tenuazonic acid (TeA), respectively.<br />Starting from the development of a fast and reliable procedure for the synthesis of zearalenone-14-[beta],D-glucuronide (ZEN-14-GlcA), reasonable amounts of this metabolite were prepared for further investigations, including the evidence of preferred formation of ZEN-14-GlcA by hepatic and intestinal microsomes and the development of a biomarker LC-MS/MS method for proper exposure assessment. Applying structurally simple resorcylic acid esters as mimics for ZEN, the simultaneous preparation of glucosides and glucuronides of the ZEN metabolites [alpha]- and [beta]-ZEL was accomplished. Additionally, ZEN-14-[beta],D-gentiobioside was prepared as the first synthetic late phase II metabolite of ZEN and an optimized and tunable procedure for the chemical sulfation of resorcylic acid lactones was developed and applied for the synthesis of ZEN sulfates. Glucosides and Sulfates of AOH and AME were successfully prepared after total synthesis of selectively protected derivatives and directed conjugation. Furthermore, theoretical and spectroscopic methods were applied for investigating the chemistry and structure of TeA as well as of the novel trichothecene metabolites pentahydroxyscirpene (PHS) and S-methyldeoxynivalenol (SMD). The exact structure of TeA and its tautomerism in solution was studied by quantum chemical calculations and the synthesis of TeA was investigated applying computational methods for a better understanding of procedures leading to 3-acyltetramic acids, an important class of natural products. The structure of PHS, a novel Fusarium metabolite, was elucidated by NMR spectroscopy and single crystal X-ray analysis. The absolute configuration was confirmed by diastereoselective reduction of NIV leading to PHS. SMD was prepared applying an optimized procedure for thia-Michael addition and its structural behavior was studied by NMR and theoretical methods leading to confirmation of an unexpected hemiketalization of thia-Michael adducts of trichothecenes.<br />Since common methods for chemical glycosylation are not applicable for the synthesis of further mycotoxin conjugates, e.g. trichothecene glycosides, a novel strategy for diastereoselective glycosylation was developed within this PhD thesis. Benzyl protected glucosyl donors were prepared bearing a benzyloxycarbonyl (Cbz) group at O-2 leading to 1,2-trans glycosylation ensured by the anchimeric effect of the Cbz moiety during glycosylation. This prospective approach will be extended and applied for the synthesis of mycotoxin glycosides and natural products in the future.<br />