Micropatterned surfaces and single molecule microscopy for characterization of the cellular plasma membrane structure / eingereicht von: Stefan Sunzenauer

• VerfasserIn: Sunzenauer, Stefan
• Place / Publishing House: 2012
• Year of Publication: 2012
• Language: English
• Classification: 33.05 - Experimentalphysik; 42.12 - Biophysik
• Physical Description: 160 S.; Ill., graph. Darst.
• Notes: Zsfassung in dt. Sprache

ger: Um die Mechanismen welche Zellfunktion und Metabolismus steuern zu verstehen ist es von entscheidender Wichtigkeit das Interaktionsnetzwerk der Moleküle in lebenden Zellen zu kennen. Direkte Protein-Protein Wechselwirkungen sind die prominentesten Vorgänge in einer Zelle. Es gibt einige Methoden um diese Interaktionen zu finden und zu charakterisieren. Affinitätschromatographie von Interaktionspartnern welche in der Folge mittels Massenspektroskopie bestimmt werden oder Resonanzenergietransfer basierende Methoden werden häufig angewandt. Diese Methoden haben gewisse Nachteile:<br />Affinitätschromatographie ist anfällig für falsch positive Resultate und schwache Wechselwirkungen können nicht detektiert werden.<br />Resonanzenergietransfer basierende Methoden können keinen großen Durchsatz generieren und die Ergebnisse sind schwer zu interpretieren.<br />In dieser Arbeit verwendete ich eine direktere Methode um Wechselwirkungen zu charakterisieren: Auf einem Mikrobiochip werden bestimmte Membranproteine in einer lebenden Zelle in geometrischen Strukturen angeordnet und das Verhalten fluoreszenzmarkierter Beutemoleküle wird in Abhängigkeit der Verteilung der immobilisierten Köderproteine studiert. In einem Projekt welches in dieser Arbeit präsentiert wird zeigte ich, dass mikrostrukturierte Oberflächen verwendet werden können um Dissoziationskonstanten zu messen und fand eine KD von 3,5 nM für die Bindung zwischen einem Anti-Maus-Antikörper und einem Maus-Antikörper. Außerdem nützte ich diese Methode um die von VEGF initiierte Interaktion des Urokinase-Rezeptors mit dem Fibronektin-Rezeptor Integrin- [alpha]5[beta]1 in menschlichen Endothelzellen aus Nabelschnüren zu untersuchen. Das Zelluläre Interaktionsnetzwerk besteht nicht nur aus direkten Protein-Protein Wechselwirkungen, es wird vermutet dass auch nanoskopische Lipidplattformen eine wichtige Rolle spielen. Man glaubt, dass sich gewisse Proteine bevorzugt in diesen Plattformen aufhalten ohne sich stark zu binden. Das macht Lipid-vermittelte Interaktionen sehr schwer detektierbar. In dieser Arbeit habe ich solche Membranstrukturen mit der Mikrostrukturierungsmethode untersucht, welche sich hierfür sehr gut eignet, da sie auch schwache Interaktionen detektieren kann. Ich habe in lebenden Zellen gezeigt, dass CD4, ein wichtiger Ko-Rezeptor bei der T-Zell-Aktivierung, und Lck, eine im frühen T-Zell Signalisierungsprozess wichtige Tyrosinkinase, zusätzlich zu ihrer direkten Zink-basierten Bindung ko-lokalisieren: 9 Lck-Moleküle pro CD4 Molekül wurden in CD4 angereicherten Regionen gefunden. Das gleiche zeigte ich für das GPI verankerte CD59 und ein mit dem GPI-Anker von DAF in der Membran verankertes GFP. Diese Interaktion wurde in einer Einzelmolekülstudie weiter analysiert, welche mich zu einem Modell der Membranorganisation führte, in dem GPI verankerte Proteine präferentiell in nanoskopischen Lipiddomänen eingeschlossen sind. Während diese Proteine auf einer größeren Skala aufgrund ihrer Unfähigkeit die sich selbst bewegenden Plattformen zu verlassen gebremst werden, diffundieren sie innerhalb dieser Domänen viel schneller. Basierend auf diesem Modell erwäge ich die Möglichkeit dass "Lipid Rafts" als Schalter für Proteininteraktionen wirken könnten.<br />

eng: Unraveling the interaction network of molecules in living cells is key to understanding the mechanisms that regulate cell metabolism and function. Direct protein-protein interactions are the most prominent events in a cell. Today there are several methods available to find and characterize these interactions. Affinity purification of interaction partners and subsequent mass spectrometry or energy transfer based methods are widely used. These methods have to deal with several problems: Affinity purification is prone to false positives and might not detect weak interactions. Energy transfer based methods lack high throughput possibilities and also the interpretation of the results is very difficult. In this thesis I used a more direct method to characterize interactions: On a micro-biochip certain membrane proteins in a live cell are forced into geometric structures and the behavior of fluorescently marked prey proteins is studied with respect to the distribution of the immobilized bait proteins. In one project presented in this thesis I demonstrated that micropatterned surfaces can be used to determine dissociation constants and found a KD of 3.5 nM for an antibody-antigen interaction. Another project is presented where I used this method to investigate the vascular endothelial growth factor (VEGF)-initiated interaction of the urokinase receptor (uPAR) with fibronectin receptor integrin-[alpha]5[beta]1 in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs).<br />The cellular interaction network consists not only of direct protein-protein interactions, it is believed that also nanoscopic lipid platforms in the plasma membrane play a crucial role. It is thought that specific proteins prefer partitioning in these platforms without a strong binding. This makes lipid-mediated weak interactions hard to detect. In this thesis I studied such membrane features using the micropatterning method which is ideal in that case due to its ability to test weak interactions. I have shown that CD4, the major co-receptor in T cell activation, and Lck, a protein involved in early T-cell signaling, co-localize additionally to their known zinc clasp structure-based binding: 9 Lck molecules were found to be recruited by a single CD4 molecule to CD4-enriched regions in live cells. The same was demonstrated for the GPI-anchored CD59 and a GPI-DAF anchored GFP. This interaction was further analyzed in a single molecule tracking study which led me to a model of membrane organization where GPI-anchored proteins are preferentially enclosed in nanoscopic lipid domains. While these proteins are slowed down on a larger scale due to their disability to leave these small and slowly diffusing domains, they can diffuse at a higher speed within the domain itself. Based on this model I speculate that lipid rafts might act as switch for protein interactions.<br />