STAT6 controls the expression of the IL-4-regulated genes TCF-1 and IL-31 in naive CD4+ [CD4 hoch +] T cells undergoing Th2 development / vorgelegt von Elisabeth Maier

• VerfasserIn: Maier, Elisabeth
• Place / Publishing House: 2011
• Year of Publication: 2011
• Language: English
• Classification: 44.45 - Immunologie; 42.13 - Molekularbiologie
• Physical Description: 65 Bl.; Ill., graph. Darst.; 30 cm
• Notes: Abweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des Verfassers

ger: Th2 Zellen vermitteln Immunität gegenüber parasitären Infektionen, sind jedoch auch maßgeblich an der Entstehung allergischer Erkrankungen beteiligt. Th2 Zellen differenzieren aus naïven T Zellen infolge von T Zell-Rezeptoraktivierung in einem Interleukin-4 (IL-4)-haltigen Milieu. Da Th2 Zellen selbst als hauptsächliche und für lange Zeit sogar als einzige Quelle für IL-4 galten, stellte sich die Frage ob auch weitere Signale die Polarisierung von Th2 Zellen aus naiven CD4+ T Zellen fördern. Mittlerweile sind sowohl andere Quellen als Th2 Zellen für IL-4 als auch weitere Signalwege für die Th2-Entwicklung identifiziert worden. Seit kurzem ist bekannt, dass der Transkriptionsfaktor TCF-1 in aktivierten naiven T-Zellen die Expression von GATA-3 anregt. GATA-3 ist der Haupttranskriptionsfaktor, der den Th2-Phänotyp determiniert und stabilisiert und unter anderem die Expression der Th2-Effektor-Zytokine IL-4, IL-5 und IL-13 reguliert.<br />Neben der aktivierenden Wirkung auf den GATA3-Promoter wurde auch eine supprimierende Wirkung von TCF-1 auf die Expression von IFN-gamma beobachtet, dem bekanntesten Th1-Effektorzytokin und Gegenspieler von Th2-Immunantworten. TCF-1 wird in verschiedenen Isoformen exprimiert, die unterschiedlich auf den GATA3-Promotor wirken. Während lange Isoformen gemeinsam mit dem Co-Faktor beta-Catenin die Transkription von GATA-3 anregen, können die von einem alternativen Promotor transkribierten kurzen Isoformen kein beta-Catenin binden und inhibieren daher die GATA3-Transkription. Die vorliegende Dissertation beschäftigte sich mit der Regulation von TCF-1 während der Th2-Polarisierung. Es konnte gezeigt werden, dass in naiven CD4+ T Zellen im Laufe der in-vitro-Polarisierung zu Th2 Zellen die TCF-1 Expression abreguliert wird. Dieser Effekt konnte auf die Wirkung des Th2-polarisierenden Zytokins IL-4 zurückgeführt werden, da IL-4 alleine ausreicht, um die TCF-1-mRNA-Expression zu inhibieren.<br />Genauere Analysen der IL-4-vermittelten Suppression von TCF-1 haben ergeben, dass IL-4 gezielt die kurzen Isoformen von TCF-1 inhibiert, welche der Th2-Entwicklung entgegenwirken. Des Weiteren wurde gezeigt, dass die Expression von TCF-1 hoch sensitiv auf IL-4 reagiert. Mithilfe von EMSA und Chromatin-Immunpräzipitation konnten 4 funktionelle STAT6-Bindestellen im TCF1-Locus identifiziert werden, was darauf hindeutet, dass die IL-4-induzierte Inhibition der kurzen TCF-1 Isoformen auf einer direkten Interaktion von STAT6 mit dem genomischen Locus für TCF-1 beruht. Diese Annahme wurde in humanen STAT6-defizienten naiven CD4+ T Zellen sowie in T Zellen aus STAT6-knockout-Mäusen bestätigt.<br />Der Großteil von IL-4 abhängigen Genen - darunter viele, die für die Th2-gesteuerte Entzündung wichtig sind - wird durch STAT6 aktiviert. Wie bereits erwähnt, zählen IL-4, IL-5 und IL-13 zu den charakteristischen Th2-Effektorzytokinen. Diese Gruppe wurde unlängst um das Zytokin IL-31 erweitert. IL-31 ist ein Typ I Zytokin aus der IL-6-Familie. Transgene Mäuse, in denen IL 31 überexprimiert wird, weisen einen Phänotyp auf, der dem der Atopischen Dermatitis ähnelt. Patienten mit Atopischer Dermatitis haben erhöhte Serumwerte für IL-31, die mit erhöhten Werten für IL-5, IL-4 und IL-13 korrelieren. Aus Mausstudien ist bekannt, dass IL-31 von aktivierten CD4+ Zellen, vor allem Th2 Zellen, sezerniert wird. Der zweite Teil dieser Dissertation behandelt die Expression von IL-31 in humanen Th-Zellen und die molekularen Mechanismen, die dieser zugrunde liegen. Durch in-vitro-Polarisierung aus naiven humanen CD4+ Zellen generierte Th1, Th2, Th9, Th17 und iTreg Zellen wurden mittels ELISA auf die Fähigkeit getestet, IL-31 zu sezernieren. Es hat sich gezeigt, dass nicht nur Th2-Zellen, sondern auch Th9-Zellen - wenn auch in geringerem Maße - IL-31 produzieren. Diese beiden Effektor-T Zell-Typen entwickeln sich in Abhängigkeit von IL-4. IL-4 induziert die Expression von IL-31 mRNA in naiven CD4+ T Zellen. Die IL-31-Expression lässt sich verstärken, wenn die Zellen zusätzlich mit aktivierenden Antikörpern gegen CD3 und CD28 behandelt werden. Im IL31 Promotor befinden sich zwei STAT6-Bindestellen, die in der Lage sind, STAT6 im EMSA zu binden. Die essentielle Rolle, die diese für die IL-31-Promoteraktivität spielen, wurde anhand von Luciferase-Reportergen-Experimenten untersucht. Mittels siRNA-Knockdown von STAT6 in humanen T Zellen wurde gezeigt, dass STAT6 Voraussetzung für die IL-4-abhängige Expression von IL-31 in humanen Th Zellen ist.<br />Dies deutet darauf hin, dass STAT6 der Haupttranskriptionsfaktor für IL 31 ist.<br />Zusammenfassend wurde anhand der Beispiele TCF-1 und IL-31 gezeigt, dass der IL 4/STAT6-Signalweg als negativer und positiver Regulator von Th2 assoziierten Genen sowohl in der Th2 Entwicklung als auch in differenzierten Th2 Zellen wirkt.<br />

eng: Th2 cells mediate host defense against parasitic infections and play a role in allergic disease. Th2 cells develop from naïve CD4+ T cells upon T cell receptor stimulation in an IL-4 containing environment. The main and for a long time only known source of IL-4 are Th2 cells themselves. Although other sources of IL-4 are known to date and IL-4 independent Th2 polarisation pathways have been described, IL-4 is still considered the most important player in the onset and progression as well as function of Th2 effector cells. One of the latest described IL-4 independent Th2 polarising mechanisms involves the Wnt pathway transcription factor T cell factor-1 (TCF-1). Upon T cell receptor (TCR) stimulation, TCF-1 activates the expression of GATA-3, which in turn initiates IL-4 expression. Moreover, it was demonstrated that TCF-1, besides skewing naïve T cells towards the Th2 branch, also suppresses the expression of the Th1 signature cytokine IFN-gamma. TCF 1 is expressed in several isoforms that arise from alternative promoter usage and alternative splicing. Transcripts derived from the upstream promoter are translated into fully functional TCF 1 isoforms, whereas the downstream TCF1 promoter gives rise to TCF-1 proteins that lack the beta-catenin binding domain and thus are persistent transcriptional repressors. The present thesis project investigated the regulation of TCF-1 isoforms in naïve human CD4+ T cells undergoing Th2 polarisation. It was shown that stimulation of naïve CD4+ T cells with anti-CD3/anti-CD28 and interleukin 4 (IL-4) down-regulates TCF-1 expression in a time and concentration dependent fashion. The observed inhibition of TCF-1 expression can be completely assigned to the action of IL-4 because the sole treatment with IL-4 is sufficient to repress TCF-1. IL-4 mediated TCF-1 suppression does not affect all isoforms in the same way, but is primarily restricted to the suppressive isoforms that lack the beta-catenin interaction domain. Of note, it could be shown that TCF-1 is highly sensitive to IL-4. IL-4 induced transcriptional regulation mainly involves the transcription factor signal transducer and activator of transcription 6 (STAT6). Electrophoretic mobility shift assays (EMSA) and chromatin immuno-precipitation demonstrate direct interaction of STAT6 with the human TCF1 locus. Silencing STAT6 in naïve human CD4+ T cells rescued the expression of TCF-1, in particular the short isoforms, from IL-4 induced suppression. A similar effect was observed in mouse T cells derived from STAT6 deficient animals. Taken together, this study shows that the IL-4/STAT6 pathway down-regulates the expression of TCF-1 isoforms that act on GATA-3 expression in a negative way and may thus facilitate manifestation of the Th2 phenotype.<br />In contrast to TCF-1, the majority of IL-4-dependent genes - most of them are associated with Th2 inflammation - are positively regulated by STAT6. The latest addition to the group of Th2 effector cytokines is interleukin 31 (IL-31). IL-31 is member of the IL-6 family of cytokines.<br />Mice over-expressing IL 31 have an atopic dermatitis (AD) like skin phenotype. Moreover, AD patients have elevated serum levels of IL-31 compared to healthy controls. The second part of the present thesis investigates the expression of IL-31 in human CD4+ T cell subtypes and its underlying molecular mechanisms. So far, IL-31 was shown to be expressed in activated mouse CD4+ T cells, predominantly Th2 cells.<br />Enzyme linked immuno sorbent assay of in vitro polarised T helper cell subsets revealed that IL-31 is not only produced under Th2-, but also - although in minor amounts - under Th9-polarising conditions. Both cell types are implicated in the defence against parasitic pathogens as well as in allergic diseases and require IL-4 for their development. Realtime PCR data show up-regulation of IL-31 mRNA in response to IL-4 treatment or anti-CD3/anti-CD28 stimulation with the highest expression detected when both stimuli are present. Analysis of the IL31 promoter revealed the presence of two STAT6-binding sites that were shown to bind STAT6 in EMSA. The contribution of each STAT6-binding site identified within the human IL31 promoter to the expression of IL-31 was determined by luciferase reportergene assays. It was shown that both STAT6 sites are required in IL-4 mediated expression of IL-31. Critical involvement of STAT6 in IL-31 mRNA expression in human T cells was demonstrated by siRNA-mediated silencing of STAT6. Taken together, the current thesis showed for the examples of TCF-1 and IL-31 that the IL 4/STAT6 signalling pathway acts as positive and negative regulator of Th2 associated genes in Th2 development as well as in established Th2 cells.<br />