Combined atomic force and fluorescence microscopy to study lipid transfer from lipoproteins to biomembranes / eingereicht von: Birgit Plochberger

• VerfasserIn: Plochberger, Birgit
• Place / Publishing House: 2010
• Year of Publication: 2010
• Language: English
• Classification: 42.12 - Biophysik; 42.03 - Methoden und Techniken der Biologie
• Physical Description: XII, 111 S.; Ill., graph. Darst.
• Notes: Zsfassung in dt. Sprache

ger: Biologische Zellen nehmen ihre Umgebung über hochspezifische Rezeptor- Liganden Wechselwirkungen wahr. Die unmittelbar beteiligten Rezeptoren befinden sich an der zellulären Plasmamembran und reagieren in der Regel über komplexe molekulare Interaktionsprozesse auf den externen Stimulus.<br />Gegenwärtig geht man davon aus, dass die räumliche Anordnung der Rezeptoren massiv deren Funktionsweise beeinflusst. Durch gezielte Stimulierung einzelner Rezeptormoleküle kann man deren Funktionsweise - Molekül für Molekül - charakterisieren. Die molekulare Erkennungs-Kraft-Mikroskopie bietet ein fantastisches Instrument um spezifisch einzelne Rezeptormoleküle zu stimulieren. Dazu wird der entsprechende Ligand über einen exiblen Linker an eine Atomkraftspitze gebunden. Umgekehrt erlaubt Fluoreszenzmikroskopie, insbesondere auf Einzelmolekülebene den Zeitverlauf der Signalprozessierung zu messen. Durch das Zusammenführen der beiden Messtechniken ermöglicht man weitere Einblicke in zelluläre Prozeße, indem man die kontrollierte Stimulierung mithilfe einer funktionalisierten Atom-Kraft-Spitze direkt mit der zellulären Antwort korreliert, wobei diese wiederum mit der Fluoreszeszenzmikroskopie bestimmt wird.<br />Zu Beginn meiner Dissertation beschäftigte ich mich damit, ein derart vollständig synchronisiertes Fluoreszenz- und Atomkraftmikroskop auf Einzelmolekül-Ebene aufzubauen. In weiterer Folge fand das kombinierte Mikroskop seine Anwendung zur Untersuchung von individuellen transferierten Lipiden aus dem High Density Lipoprotein (HDL)-Partikel in die Lipiddoppelschicht. Generell wird vermutet, dass dieser Prozeß rezeptorabhängig ist, folgedessen interessierte mich im Speziellen der Transfer von Fluoreszenzmakierten Lipiden in Abhängigkeit des Rezeptors.<br />Bei der Untersuchung der Wechselwirkung zwischen einem HDL-Partikel und einer Lipiddoppelschicht zeigte sich, dass Lipide wie Cholesterin auch ohne das Vorhandensein eines Rezeptors in die künstliche Membran transferiert werden können. Ein derartiges Verhalten konnte ich jedoch nicht für den cholesteryl Ester beobachten.<br />Die gleichzeitige Aufzeichnung von abgegebenen Lipiden und die Möglichkeit Kontaktzeiten, sowie Kontaktkraft zu variieren, trägt wesentlich dazu bei, biologische Prozesse besser zu verstehen.<br />Zusätzlich zeigte sich, dass zwischen Membran und HDL-Spitze eine Wechselwirkung stattfindet, die auf die Ausbildung von Lipidröhren hindeutet.<br />Weiters charakterisierte ich das Verhalten von Lipiden, im Speziellen von oxidierten Phospholipiden, mithilfe von Einzelmolekülmikroskopie und Fluoreszenz-Korrelation-Spektroskopie (FCS) in unterschiedlichen Phasen separierter Lipiddoppelschichten. Oxidierte Phospholipide sind ein Bestandteil von Low Density Lipoprotein (LDL) Partikeln, werden jedoch auch in HDL Partikeln vermutet. Meine Messungen zeigten, dass derartige Lipide - verglichen mit konventionellen Lipiden - eine erhöhte Diffusionskonstante in Lipidmembranen haben. Dieser Effekt wird durch Zugabe von hohen Cholesterolkonzentrationen stark reduziert, indem Cholesterol dazu neigt oxidierte Lipide in die Membran zu ziehen. Außerdem können oxidierte Lipide durch ihr lysolipid-ähnliches Verhalten besser komplexer Lipid-Matrizen passieren, als herkömmliche Lipide.<br />

eng: Biological cells notice there environment via highly sensitive receptor-ligand interactions. The involved receptors reside at the cellular plasma membrane and react along complex molecular processes to the external stimulus.<br />The spatial arrangement of the receptors affect their function strongly. By stimulating specific receptors -molecule by molecule- we can characterize their function. Atomic Force Microscopy (AFM) enables controlled stimulation of single receptor molecules. For this purpose the corresponding ligand is attached via a flexible linker to the cantilever tip. In contrast, fluorescence microscopy allows for measuring the time response of the signal processing, even at the single molecule level. It is the combination of both approaches, however, which paves the way for reaching new levels of understanding of cellular processes, as molecular trigger set by the functionalized AFM tip can be directly correlated to the cellular response measured by fluorescence microscopy.<br />In this thesis, I firstly developed the instrumentation for combined and fully synchronized force and fluorescence microscopy, down to the level of single molecules. Secondly, I applied the new instrumentation to study the transfer of individual lipid molecules out of an HDL-particle into supported lipid bilayers, which serve as well defined model membranes. In particular, the transfer of fluorescently labeled lipids as a function of the receptor for selective cholesterol uptake was of major interest. It is generally assumed that this process is a receptor-mediated transfer of lipid from the particle directly into the cellular plasma membrane. By analyzing the interaction of HDL-particles and a supported lipid bilayer, I could demonstrate that cholesterol can indeed be transferred from an HDL particle to the bilayer without the need for a receptor; for cholesteryl ester, no transfer was observable. The ability to monitor released lipids and to adjust contact times or contact forces let us assess the biological process. In addition, by investigating the interacting forces between the HDL-particle and the membrane, I observed rupture forces, which are related to tube formation between HDL and the bilayer.<br />I further characterized properties of lipids, preferential of oxidized phospholipids, with single molecule microscopy and Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS) on phase separated bilayers. Oxidized phospholipids are known to be integral parts of LDL particles, but may also be expected in HDL particles. Here, I found that these lipids show an increased mobility in the membrane compared to conventional lipids. High cholesterol concentration reduces this effect, as cholesterol pulls the oxidized lipid into the lipid bilayer. The lysolipid-like character enables the probe to enter ordered environments, thereby providing means for spreading rapidly and homogeneously over complex matrices like the cellular plasma membrane.