Functional genomics and metabolomics of totipotent tobacco microspores / Verf.: Julia Hosp

• VerfasserIn: Hosp, Julia
• Place / Publishing House: 2006
• Year of Publication: 2006
• Language: English
• Classification: 42.43 - Pflanzengenetik
• Physical Description: 123 Bl.; Ill., graph. Darst.

ger: Junge Pollenkörner (Mikrosporen) höherer Pflanzen können isoliert und durch Stressbehandlungen dahingehend umprogrammiert werden, daß sie zu haploiden Embryonen heranwachsen anstatt den herkömmlichen Weg der Bildung von fruchtbaren Pollenkörnern einzuschlagen. Diese Besonderheit wird als Mikrosporen-Embryogenese bezeichnet und hat sich zu einem wichtigen Instrument in der Pflanzenzüchtung entwickelt. Zudem stellt der Vorgang der Embryogenese aus Mikrosporen auch in der Grundlagenforschung ein interessantes Modell zur Beantwortung von Fragen zu Zellzyklus, Totipotenz und Embryogenese dar.<br />Die zugrunde liegenden molekularen Abläufe sind allerdings noch weitgehend unbekannt. In den vergangenen Jahrzehnten haben sich Studien mit der Isolierung von einzelnen Genen befasst, die während des Umschaltprozesses in Mikrosporen bzw. in jungen haploiden Embryonen stärker exprimiert sind. Dabei wurden einige wenige Gene entdeckt, deren Expressionsmuster für embryogene Mikrosporen charakteristisch sind bzw.<br />Vorraussagen über deren weitere Entwicklung zulassen. In jüngerer Vergangenheit schufen Studien auf dem Gebiet der funktionellen Genomik die Vorraussetzung für ein klareres Bild der involvierten zellulären Prozesse.<br />Um das dennoch sehr beschränkte Wissen um diese entwicklungsbiologische Besonderheit zu erweitern, wurden mittels SSH (Suppression Subtractive Hybridisation) hinauf- bzw. hinunterregulierte Gene aus gestressten Tabak-Mikrosporen isoliert. Neunzig stark exprimierte Sequenzen wurden auf deren Expressionsmuster sowie Ähnlichkeiten zu bekannten Genen untersucht und in einer Datenbank (abrufbar unter www.univie.ac.at/ntsm) erfasst. Aufgrund von Sequenz-Homologien zu bereits bekannten Genen war es möglich, die isolierten Klone funktionellen Kategorien wie Metabolismus, Chromosomen-Remodellierung, Signaltransduktion sowie Transkription und Translation zuzuteilen. Ungefähr die Hälfte der isolierten Gene blieb jedoch unbekannt. Gleichzeitig wurden die Mengen von 270 bekannten und unbekannten Metaboliten gestresster Mikrosporen bestimmt und mit jenen ungestresster verglichen. Dabei manifestierten sich zum Teil starke Unterschiede zwischen den beiden Populationen, wie beispielsweise das Vorhandensein von großen Mengen an Isocitrat und Isomaltose in gestressten Mikrosporen. Die Ergebnisse der Transkriptions- und metabolischen Daten wiesen auf ein komplexes Muster von Prozessen hin, die während der Umprogrammierung von Mikrosporen eine Rolle spielen (z.B. Autophagie).<br />Ein Vertreter der Gruppe der stark überexprimierten Gene, ntsm10, wurde im dritten Teil dieser Arbeit näher charakterisiert. Es wurde gezeigt, daß ntsm10, ein Homolog von DCN-1 und Dcn1p aus Wurm und Hefe, 1) für ein 30kDa Protein mit unüblicher Domänenstruktur (UBA, DUF298 und EF-hand) kodiert, das in gestressten Mikrosporen stark überexprimiert ist, 2) bei Ausschaltung durch RNAi zu einer Blockade bzw. einem gestörten Ablauf in der Mikrosporen-Embryogenese führt, und 3) bei Überexpression zu erhöhtem Embryogenese-Potential von Mikrosporen beiträgt.<br />Da bei der Verwendung von RNAi keine Komplementierung von Phänotypen wie etwa bei Knock-Out Mutanten möglich ist, wurden die RNAi-Pflanzen zum zweiten Mal transformiert und zwar mit einem weiteren RNAi-Konstrukt, das den Promotor des ersten durch Methylierung inaktivieren sollte.<br />Molekularbiologische Analysen der Doppeltransformaten zeigten wie erwartet wiederhergestellte ntsm10 RNA- und Protein-Mengen. Durch diese Komplementierung konnte der zuvor beobachtete Defekt der Mikrosporenembryogenese aufgehoben werden.<br />

eng: Isolated plant microspores, when stressed and cultured in vitro, can be diverted from their normal gametophytic pathway towards sporophytic development, forming haploid embryos and ultimately doubled haploid (DH) plants. This process, called microspore embryogenesis, is widely used in plant breeding programs to generate homozygous lines and in fundamental research, as model to study plant cell totipotency and embryogenesis.<br />Despite the large body of knowledge that accumulated during the last 10-15 years, the mechanisms underlying the stress-induced switch from gametogenesis to embryogenesis are largely unknown. In the past, molecular studies on microspore embryogenesis focussed mainly on the identification of individual genes that are differentially expressed during this developmental transition and/or early in embryo development.<br />These studies identified a small collection of genes whose expression marks or predicts the developmental fate of stressed microspores. More recently, functional genomics approaches have been used to obtain a broad overview of the molecular processes that take place during the establishment of microspore embryogenesis.<br />Suppression subtractive hybridisation (SSH) and metabolic profiling were used to characterise reprogramming of tobacco microspores by starvation and heat shock stress. Following differential reverse Northern hybridisations, 90 distinct up-regulated sequences were identified in stressed, embryogenic microspores (accessible at www.univie.ac.at/ntsm).<br />Sequence analyses allowed the classification of these genes into functional clusters such as metabolism, chromosome remodelling, signalling, transcription and translation, while the putative functions of 47% of the sequences remained unknown. A comparison of metabolic profiles of nonstressed and stressed microspores using gas chromatography/ mass spectrometry (GC/MS) identified 270 known and unknown compounds, partly displaying significant changes in metabolite levels, e.g. highly elevated levels of isocitrate and isomaltose in stressed microspores when compared to non-stressed microspores. The formation of embryogenic microspores is discussed on the basis of the identified transcriptional and metabolic profiles that suggest the involvement of several cellular processes such as autophagy.<br />One of the identified cDNAs, named ntsm10 (Nicotiana tabacum stressed microspores 10), was examined in detail with respect to its molecular and functional characteristics in microspore embryogenesis. We show that ntsm10, a homolog of DCN-1 and Dcn1p of worm and yeast, respectively, 1) encodes a 30 kDa protein with UBA, DUF298 and EF-hand domains that is highly expressed in stressed tobacco microspores, 2) leads to an arrest and/or delay in microspore embryogenesis if knocked-down and 3) leads to enhanced dedifferentiation speed of microspores if overexpressed.<br />RNA interference has become a popular method for knocking down genes of interest. A drawback of the RNAi approach, however, is that routine complementation of observed phenotypes as is done in Arabidopsis knock out mutants has not been established. Yet, by retransforming RNAi (PTGS) lines with a transcriptional gene silencing (TGS) construct directed against the RNAi-driving promoter, we were able to demonstrate restoration of the ntsm10 phenotype.