Double-stranded RNA-binding domains : modulators of nuclear localization of the human RNA-editing enzyme ADAR1 / eingereicht von Alexander Strehblow

• VerfasserIn: Strehblow, Alexander
• Place / Publishing House: 2005
• Year of Publication: 2005
• Language: English
• Classification: 42.13 - Molekularbiologie; 42.15 - Zellbiologie; 42.20 - Genetik
• Physical Description: 113 Bl.; Ill.
• Notes: Zsfassung in dt. Sprache
• ac_no: AC04908393
• Hierarchical level: Monograph
• Statement of Responsibility: eingereicht von Alexander Strehblow

ger: Das RNA editierende Enzym hsADAR1 (homo sapiens adenosine deaminase that acts on RNA 1) desaminiert Adenosine zu Inosinen in doppelsträngiger RNA. HsADAR1 ist ein transkriptionsabhängiges Shuttling Protein, das in zwei Versionen exprimiert wird. Die längere, Interferon-induzierbare Form ist vorwiegend cytoplasmatisch und enthält ein klassisches, Leuzin-reiches Exportsignal (NES) im N-Terminus, welches in der kürzeren, konstitutiv exprimiereten Version, die hauptsächlich im Kern zu finden ist, nicht inkludiert ist. Um in den Nukleus zu gelangen, wird ein Lokalisationssignal (NLS), das in der C-terminalen der drei Doppelstrang-RNA-bindenden Domänen (dsRBD) gelegen ist, von einem Importrezeptor erkannt. Jedoch spielt auch die aminoterminale dsRBD eine wichtige Rolle in der Regulation des Kerntransports von hsADAR1.<br />Reporterkonstrukte, die diese beiden dsRBDs enthalten, akkumulieren in einer RNA-bindungsabhängigen Weise im Cytoplasma, obwohl ein aktives NLS vorhanden ist.<br /> In dieser Arbeit wurde die Rolle der dsRBDs in der Regulation der nukleo-cytoplasmatischen Verteilung des Enzyms analysiert. Einerseits wurde versucht, das atypische Kerntransportsignal zu charakterisieren, indem potentielle NLS-aufbauende Aminosäuren mit Hilfe von chimären dsRBD-Konstrukten, Sequenzanalysen und 3D-Strukturmodellen identifiziert wurden. Ein finales Konstrukt, das alle Kandidaten in einer ansich nicht NLS-aktiven dsRBD enthielt, wurde aber nicht in den Kern befördert. Das legt den Schluss nahe, dass alle Aminosäuren, die für NLS-Aktivität wichtig sind, über die gesamte, eine möglicherweise einzigartige Struktur aufweisende dsRBD verteilt sind. Darüberhinaus wurden verschiedene Importrezeptoren darauf getestet, ob sie an das NLS von hsADAR1 in vitro binden bzw. diese es in Importassays in den Kern transportieren können. Dabei stellte sich heraus, dass Transportin-1 der wahrscheinlichste Kandidat ist. Andererseits wurde untersucht, ob die N-terminale dsRBD von hsADAR1 als NES fungiert, das von Exportin-5, einem Karyopherin, das Export von RNA-bindenden Proteinen via Interaktion mit deren dsRBD vollzieht, erkannt wird. Obwohl Exp5 ADARs dsRBDs in Abhängigkeit von RNA und RanGTP binden kann, scheint der Exportfaktor unter Berücksichtigung aller Ergebnisse dennoch kein wahrscheinlicher Kandidat zu sein, hsADAR1 aus dem Kern zu transportieren.<br /> eng: The RNA editing enzyme hsADAR1 (human adenosine deaminase that acts on RNA 1) converts adenosines to inosines in double-stranded RNA.<br />HsADAR1 is a transcription-dependent shuttling protein and expressed in two versions. The interferon inducible, longer version contains a Crm1-dependent nuclear export signal (NES) in the N-terminus and is located to both, the nucleus and the cytoplasm, where it is suggested to hyperedit viral RNAs. In contrast, the shorter, aminoterminally truncated version is constitutively expressed and predominantly nuclear.<br />To enter the nucleus hsADAR1 contains an atypical nuclear localization signal (NLS) overlapping the third double-stranded RNA binding domain (dsRBD) in the center of the enzyme. Previous investigations addressed the question which regions of hsADAR1 contribute to regulate the nucleocytoplasmic distribution of the enzyme. We could demonstrate that dsRBD1 of hsADAR1 interferes with nuclear localization of a reporter construct containing dsRBD3 as an active NLS. Furthermore, RNA-binding is required for the import-interfering function of dsRBD1, but not for the NLS activity of dsRBD3. Finally, two competing models were developed predicting either that hsADAR1 is anchored in the cytoplasm or that dsRBD1 acts as an RNA-binding dependent NES.<br /> This study is concentrating on the characterization of the roles of dsRBD1 and 3 in the shuttling behavior of the enzyme. On the one hand, to examine which residues within dsRBD3 are essential for NLS-karyopherin interaction, chimeric dsRBDs with and without NLS activity were constructed and tested for their ability to enter the nucleus, while sequence alignments and analysis of crystal structure data were used to reduce the number of candidate amino acids, which were finally substituted in a dsRBD without NLS activity. The fact that all chimeric and mutant dsRBDs failed to accumulate in the nucleus indicates that NLS comprising residues are spread throughout the entire dsRBD.<br />Additionally, several karyopherins were tested in pull down and import assays whether they can interact with dsRBD3 and mediate nuclear import of hsADAR1. Recent data revealed Transportin-1 as the most probable candidate. On the other hand, to elucidate the mechanism that interferes with nuclear accumulation of hsADAR1, experiments were focused on Exportin-5, a karyopherin exporting dsRBDs and micro RNAs. Although the export factor binds ADAR1s dsRBDs in a RNA- and RanGTP dependent manner in vitro, cell based assays fail to confirm an involvement of Exp5 in the nuclear export of ADAR1.