Entwicklung von RNA-Interferenzmethoden zur funktionellen Analyse essentieller Gene / vorgelegt von Christiane Eva Müller

• VerfasserIn: Müller, Christiane Eva
• Place / Publishing House: 2005
• Year of Publication: 2005
• Language: German
• Classification: 44.47 - Pathologie
• Physical Description: V, 129 Bl.; Ill., graph. Darst.
• Notes: Zsfassung in engl. Sprache
• ac_no: AC04530389
• Hierarchical level: Monograph
• Statement of Responsibility: vorgelegt von Christiane Eva Müller

ger: RNA-Interferenz hat sich in den vergangenen Jahren zu einem bedeutenden gentechnologischen Werkzeug entwickelt, das die funktionelle Analyse von Genen erlauben soll. Es handelt sich dabei um eine schnelle und spezifische Methode, um Gene auszuschalten und loss of function Phänotypen in Gewebekulturzellen zu analysieren. Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung neuer Werkzeuge für die effiziente Anwendung von RNAi in humanen Zellen ebenso wie die Entwicklung eines induzierbaren RNAi-Systems für den konditionellen knock down von Genen. RNAi ist nicht nur ein wichtiges Werkzeug für die Funktionsanalyse von Genen geworden, sondern erweist sich zudem als vielversprechende therapeutische Option im Kampf gegen Viren und Krebs. Ich habe RNAi unter der Verwendung von chemisch synthetisierten und in vitro transkribierten siRNAs als silencing trigger erfolgreich in humanen Gewebekulturzellen etabliert. Bei der Verwendung von siRNAs gegen den Zellzyklusregulator CDC20 konnte ich effiziente Zielsequenzen zum knock down dieses Gens finden, durch die mir im Folgenden die Testung von intrazellulären shRNA-Expressionsystemen erlaubt war. Diese werden von RNA-PolymeraseIII-Promotoren exprimiert und induzieren RNAi.<br />Wir haben eine Vielzahl verschiedener shRNA-Expresisonsvektoren unter Verwendung des U6- und H1-Promotors generiert, indem wir doppelsträngige Oligonukleotide unterhalb der beiden Promotoren klonierten. Wir konnten zeigen, dass diese intrazellulären Expressionssysteme zur effizienten Unterdrückung von Zielgenen geeignet sind. Für die konditionelle Analyse von essentiellen Zellzyklusregulatoren generierte ich rekombinante RNA-PolymeraseIII-Promotoren, indem ich das Herzstück des Promotors mit Bindungsstellen für TetR flankierte. Wird TetR-KRAB, ein Fusionsprotein aus TetR und der KRAB-Domäne von Kox1, in Zellen koexprimiert, die mit shRNA-Expressionsplasmid transfizierten wurden, welche einen rekombinanten Promotor enthalten, wird die shRNA-Expression und somit der RNAi-Effekt unterdrückt, bis TetR-KRAB durch die Zugabe von Doxyzyklin zum Medium inaktiviert wird. Für die Generation von stabiler und induzierbarer RNAi habe ich eine Zelllinie generiert, die den Transrepressor TetR-KRAB stabil exprimiert. Ich verwendete weiters episomale Plasmide, um stabile und induzierbare RNAi zu generieren, die wie sich herausstellte in transienten Transfektionsexperimenten gut funktionierten, aber keinen dauerhaften RNAi-Effekt aufrechterhalten konnten. Durch die Verwendung des GATEWAY-Systems, das auf einem schnellen und effizienten Transfer von DNA-Elementen durch Rekombination basiert, konnte ich mit einem lentiviralen Expressionssystem eine Methode für die stabile und induzierbare RNAi etablieren. Durch dieses System war ich nun in der Lage konditionelle knock down Zelllinien zu generieren. Zusammenfassend habe ich mein Ziel, ein System zur stabilen und induzierbaren Gensuppression in humanen Zellen zu etablieren, erreicht.<br />Dieses RNAi-System basiert auf dem lentiviralen Transfer einer Tetrazyklin kontrollierten RNA-PolymeraseIII abhängigen shRNA-Expressionskassette. eng: RNA interference (RNAi) has become a powerful tool to analyze the function of genes in human cells. It is a fast and specific method to knock down genes to analyze loss-of-function phenotypes in tissue culture cells. The aim of my thesis was to develop novel tools for efficient RNAi in human cells, including the development of a lentiviral RNAi expression system for stable RNAi as well as the development of inducible RNAi for conditional gene inactivation. RNAi is not only an important tool to study the function of genes but may become an important part of the gene therapy armory to combat life threatening diseases, such as cancer.<br />I have successfully established RNAi in human tissue culture cells using chemically synthesized short interfering RNA (siRNA) duplexes as well as in vitro transcribed siRNAs to trigger RNAi. Using different siRNAs against the cell cycle regulator Cdc20, I could identify suitable target sequences to further test the efficiency of short hairpin RNAs (shRNA), expressed from RNA polymerase III dependent promoters, to induce RNAi. We have constructed versatile vectors containing the U6 or H1 promoter and cloned double stranded oligonucleotides encoding shRNAs downstream of the U6/H1 promoter. These plasmids were then shown to effectively suppress the expression of the target gene in transfected cells.<br />For generating conditional cell lines to study essential cell cycle regulators, I have modified RNA-polymeraseIII dependent promoters by flanking the core promoter with binding sites for bacterial TetR. When TetR-KRAB, a fusion protein of TetR and the KRAB domain of Kox1 was co-expressed in cells with a shRNA expression plasmid containing one of these recombinant promoters, RNAi did not occur unless TetR-KRAB was inactivated by the addition of doxycycline to the cell culture media. I then used episomal plasmids for stable and inducible RNAi, which worked in transient transfection assays but not in long-term gene silencing experiments, because only expression of the selection marker gene but not the shRNA was retained. To facilitate the generation of different vector systems for the delivery of this conditional shRNA expression cassette, I have constructed a set of GATEWAY compatible vectors. Using this system I could show that lentiviral delivery is suitable for long term conditional RNAi in human cells.