Regulation of tissue factor cytoplasmic domain phosphorylation / eingereicht von Andrea Dorfleutner

• VerfasserIn: Dorfleutner, Andrea
• Place / Publishing House: Wien, 2003
• Year of Publication: 2003
• Language: English
• Classification: 35.70 - Biochemie: Allgemeines
• Physical Description: 58 Bl.; Ill., graph. Darst.; 29 cm
• Notes: Literaturverz. S. 52 - 55

ger: Die extrazellulaere Domaene des Gewebefaktor (tissue factor, TF) ist weitlaeufig fuer die Aktivierung der Blutgerinnungskaskade bekannt, aber ueber moegliche Signaluebertragungsmechanismen durch die intrazellulaere Domaene ist noch wenig bekannt. In Monozyten und Endothelzellen kann TF durch Zytokine und Mitogene induziert werden, unter anderem auch durch den Proteinkinase C (PKC)-Aktivator Phorbol 12-Myristat 13-Azetat (PMA). PMA fuehrt auch zur Phosphorylierung der intrazellulaeren Domaene von TF, aber die Bedeutung und Regulation der Phosphorylierung ist nicht naeher charakterisiert. Um den Phosphorylierungsvorgang besser untersuchen zu koennen wurde ein spezifischer Antikoerper fuer die phosphorylierte Form der TF zytoplasmatischen Domaene und insbesondere fuer phosphoryliertes Serin 258 hergestellt. Phosphorylierung wurde dann in humanen nabelschnurvenoesen Endothelzellen (HUVEC) analysiert. Zuerst konnte durch ein chimaeres Protein aus der extrazellulaeren und Transmembran-Domaene des Interleukin-2 Rezeptors (IL-2R) und der intrazellulaeren Domaene von TF (IL-2RTF) gezeigt werden, dass die extrazellulaere und die Transmembran-Domaene von Wildtyp TF fuer die PMA-induzierte Phosphorylierung der zytoplasmatischen TF Domaine nicht notwendig sind und dass diese nicht konstitutiv phosphoryliert wird. Ueberraschenderweise konnte nur Golgi-gereiftes und an der Zelloberflaeche exprimiertes Protein phosphoryliert werden. Die Phosphorylierung von Serin 258 in der TF zytoplasmatischen Domaene involviert wahrscheinlich die PKCa Isoform und benoetigt ausserdem cholesterolhaeltige "raft" Domaenen der Zellmembran. Ueberexprimierter Wildtyp-TF und endogener TF aus konstitutiv TF-exprimierenden J82 und HaCat Zellinien wurde durch PMA Stimulierung nur sehr schwach phosphoryliert. Allerdings fuehrte Mutation von Cystein 245 zu Serin in der zytoplasmatischen Domaine von Wildtyp TF und Inhibierung der Cystein-Palmitoylierung zu erhoehter Phosphorylierung bei PMA Stimulierung. Dadurch wird klar, dass neben der Transmembran- und extrazellulaeren Domaene von TF auch Palmitoylierung der zytoplasmatischen Domaene an Cystein 245 die PMA-induzierte Phosphorylierung von TF reguliert. Die procoagulante Funktion der TF extrazellulaeren Domaene wurde durch Mutation oder Phosphorylierung der zytoplasmatische Domaene nicht wesentlich beeinflusst. Zusammengefasst kann man aus den Daten schliessen, dass PKC Aktivierung durch PMA und eventuell andere unbekannte Agonisten die Phosphorylierung von Serin 258 in der TF zytoplasmatischen Domaene bewirkt und dadurch die Bindung oder Dissoziation von Adaptoren fuer die Signaltransduktion reguliert wird. p85, die regulatorische Untereinheit von Phosphatidyl-Inositol-3-Kinase (PI3K), bindet zum Beispiel ausschliesslich an die unphosphorylierte zytoplasmatische Domaene von TF. Dies koennte fuer die physiologische Funktion der TF zytoplasmatischer Domaene bei der Signaltransduktion von Bedeutung sein.

eng: The extracellular domain of the cell surface receptor tissue factor (TF) is best known for its function as activator of the coagulation cascade, but little is known about intracellular signal transduction mechanisms initiated by the TF cytoplasmic domain. TF is induced in monocytes and endothelial cells by various cytokines and mitogens, including the protein kinase C (PKC) activator phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA). PMA has also been shown to phosphorylate the TF cytoplasmic domain, but what regulates TF cytoplasmic domain phosphorylation is poorly characterized. To investigate phosphorylation events a phosphorylation specific antibody, which specifically recognized phosphorylated serine 258 of the TF cytoplasmic domain, was generated. Phosphorylation of the TF cytoplasmic domain was then analyzed in human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). First, a chimeric protein of the interleukin-2 receptor (IL-2R) extracellular and transmembrane domain and the TF cytoplasmic domain (IL-2RTF) showed that the extracellular and transmembrane domain of wild-type TF were not required for PMA-induced TF phosphorylation and that there was no constitutive phosphorylation. Surprisingly, only Golgi-matured and surface expressed protein was phosphorylated. PMA induced serine 258 phosphorylation most likely involved the PKCa isoform as well as cholesterol containing raft domains in the cell membrane. Overexpressed full length TF and endogenous TF of constitutively TF-expressing J82 and HaCat cells was only weakly phosphorylated after PMA stimulation. However, mutation of cysteine 245 to serine in the wild-type TF cytoplasmic domain as well as inhibition of cysteine palmitoylation in wild-type TF led to increased phosphorylation when stimulated with PMA. This demonstrates that the transmembrane and extracellular domain of TF as well as palmitoylation of cysteine 245 within the cytoplasmic region regulate PMA-induced phosphorylation of TF. The procoagulant function of the TF extracellular domain was not dramatically influenced by mutation or phosphorylation of the TF cytoplasmic domain. In summary the data indicate that PMA or other unknown agonists can aktivate PKC and trigger phosphorylation of serine 258 in the TF cytoplasmic domain which leads to ligand binding or dissociation of signaling adaptors. The finding that p85 for example exclusively binds to the non-phosphorylated cytoplasmic domain of TF provides novel insights into the physiological function of TF cytoplasmic domain phosphorylation in cell signaling pathways.