Heat shock protein 60 as autoantigen in atherosclerosis : mapping of crossreactive epitopes recognized by anti-bacterial heat shock protein 60 antibodies / vorgelegt von Hannes Perschinka

• VerfasserIn: Perschinka, Hannes
• Place / Publishing House: Innsbruck, 2001
• Year of Publication: 2001
• Language: English
• Physical Description: 151 Bl.; Ill., graph. Darst.; 30 cm
• Notes: Zsfassung in dt. Sprache

ger: Autoimmunreaktionen gegen das Hitzeschockprotein 60 (HSP60) spielen eine Schluesselrolle bei der Entstehung von frueher Atherosklerose. Auf Grund der hohen phylogenetischen Homologie zwischen mikrobiellem und humanen HSP60 wird vermutet, dass bakterielle Infektionen Kreuzreaktivitaet gegen koerpereigenes HSP60 ausloesen koennen, welches an der Oberflaeche von gestressten Endothelzellen nachgewiesen werden kann. Aus dem Serum von klinisch gesunden Menschen mit sonographisch nachgewiesener Atherosklerose der Arterie carotis wurden Antikoerper gegen HSP60 von E.coli (GroEL), C.trachomatis und M.tuberculosis mittels Affinitaetschromatographie gereinigt. Die Reaktivitaet dieser Antikoerper mit ueberlappenden Peptiden von humanem HSP60 wurde gemessen und auf diese Weise konnten acht kreuzreaktive lineare Epitope identifiziert werden, die von allen gegen bakterielles HSP60 gerichteten Antikoerpern erkannt wurden. Durch Immunisierung mit den entsprechenden Peptiden von humanem HSP60 wurden in Kaninchen Antikoerper gegen diese linearen Epitope erzeugt. Obwohl die Antisera urspruenglich gegen humane HSP60 Peptide produziert wurden, erkannten die gereinigten Kaninchen-Antikoerper nicht nur humanes HSP60, sondern sie reagierten auch mit den bakteriellen HSP60-Homologen kreuz. In immunhistochemischen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass alle linearen kreuzreaktiven Epitope von Endothel- und Schaumzellen in fruehen atherosklerotischen Laesionen produziert werden. Um die klinische Relevanz der identifizierten linearen kreuzreaktiven Epitope untersuchen zu koennen, wurde ein ELISA entwickelt. Serum Reaktivitaet gegen die linearen Epitope konnte in allen untersuchten Individuen (n=95, Alter 50-80, klinisch gesund) nachgewiesen werden. Die statistische Auswertung zeigte, dass die Menge der Epitop-spezifischen Antikoerper stark mit den Titern gegen mykobakterielles HSP65 und humanes HSP60 korreliert ist. Konformationelle Epitope die von den gereinigten, anti-mykobakterielles HSP65 Antikoerpern erkannt werden, wurden mittels einer kombinatorischen Phagen-Bibliothek von zyklischen 7mer Peptiden identifiziert. Nach fuenf Selektionsrunden und DNS-Sequenzierung von besonders stark bindenden Klonen wurden zwei dominante Peptid-Motive identifiziert: das eine fand sich in 64 Prozent aller sequenzierten Klone, das andere in 14 Prozent. Das Motiv, welches bei 64 Prozent aller Klone gefunden wurde, stellt vermutlich ein kreuzreaktives, konformationelles Epitop dar, denn mit Hilfe einer neu entwickelten Methode fuer strukturelles Alignment von kleinen, zyklischen Peptiden mit einer Proteinoberflaeche konnten wir das dieses Motiv sowohl auf mykobakteriellem, als auch auf humanem HSP60 lokalisieren. In dieser Dissertation gelingt mir erstmals der Nachweis, dass es mehrere lineare und konformationelle HSP60 Epitope gibt, die von zwischen bakteriellem und humanen HSP60 kreuzreaktiven Antikoerpern aus Personen mit sonographisch nachgewiesener Atherosklerose erkannt werden. Die linearen kreuzreaktiven Epitope konnten mittels immunhistochemischen Methoden bereits in sehr fruehen Stadien der Atherosklerose nachgewiesen werden, gleichzeitig wurden auch die fuer die linearen Epitope spezifischen Antikoerper in unterschiedlichen Mengen in Seren klinisch gesunder Probanden nachgewiesen. Detaillierte Studien bezueglich einer Assoziation von Antikoerperreaktivitaet gegen konformationelle Epitope mit sonographisch nachweisbarer Atherosklerose sind gerade im Gange.

eng: Autoimmune reactions to Heat Shock Protein 60 (HSP60) are believed to play a key role during development of early atherosclerosis. Due to the high degree of phylogenetic conservation between microbial and human HSP60, bacterial infections might be responsible for inducing cross reactivity to self HSP60, which is expressed on the surface of arterial endothelial cells stressed by classical atherosclerosis risk factors. Serum antibodies to E.coli HSP60 (GroEL), the 60-kD chlamydial HSP and to HSP65 of M.tuberculosis were purified by affinity chromatography from clinically healthy subjects with sonographically proven carotid atherosclerosis. In the first series of experiments, the reactivity of the purified anti-bacterial HSP60 antibodies with linear overlapping human HSP60 peptides was measured. Eight shared common epitopes recognized by all anti-bacterial HSP60 antibodies on human HSP60 were identified. Linear epitope specific polyclonal antibodies were produced by immunizing rabbits with the respective peptides derived from human HSP60. Although antisera were raised against human epitopes, the purified rabbit antibodies recognized not only human HSP60 but were also cross-reactive with homologue bacterial HSP60s. The presence of the identified linear epitopes in the arterial wall in vivo was then demonstrated by immunohistochemistry, where all of the epitopes were found to be expressed in early atherosclerotic lesions by endothelial cells and foam cells. To determine the clinical relevance of the identified linear epitopes, an ELISA system for measuring linear epitope specific serum antibodies was developed. Serum reactivity to linear cross-reactive epitopes was found in all individuals studied (n=95, aged 50-80, clinically healthy). Statistical evaluation revealed, that anti-epitope antibody levels were strongly correlated with titer to mycobacterial HSP65 as well as with titer to human HSP60. In a second series of experiments conformational epitopes recognized by polyclonal anti-mycobacterial HSP65 antibodies from subjects with atherosclerosis were identified using a phage displayed random library of constrained 7mer peptides. After five rounds of selection, DNA sequencing of strongly binding clones revealed that one dominant phage displayed random peptide motif was present in 64 percent of all clones and another motif in 14 percent. The remaining clones were coding for sequences that were only selected once. Using a newly developed method for structural alignment of small constrained peptides onto a protein surface, we found the motif present in 64 percent of all clones to be represented on the surface of mycobacterial, as well as on the surface of human HSP60, indicating that this motif probably represents a cross-reactive conformational epitope. In this thesis I provide first evidence for the existence of distinct linear and conformational epitopes shared between bacterial and human HSP60 and recognized by purified antibodies from subjects with sonographically proven atherosclerosis. By immunohistochemistry, the linear epitopes could be demonstrated to be expressed in very early atherosclerotic lesions, while linear epitope specific antibodies were found in different titers also in sera of clinically healthy subjects. Detailed studies of the possible association of antibody reactivity to conformational HSP60 epitopes with sonographically demonstrable atherosclerosis are now underway.